Question

【題目】某科研小組通過農桿菌轉化法將黑麥草的抗旱基因P轉入野生型擬南芥，以驗證基因P的功能，其流程如圖所示。回答下列問題：

（1）利用PCR技術從黑麥草的DNA中分離并克隆目的基因P，______________（填“需要”或“不需要”）用限制酶進行預處理，其原因是_________________________。

（2）用Smal I和Sal I這兩種限制酶分別對含有基因P的DNA和質粒進行雙酶切，然后連接形成①______________。與雙酶切相比，用同一種限制酶對二者進行單酶切的缺點是容易造成基因P或質粒自身環化、______________。

（3）將②的花序浸入農桿菌懸浮液以實現轉化，在適宜條件下培養，收獲@的種子，在含潮霉素（一種抗生素）的MS培養基上篩選得到③，這表明質粒載體攜帶的選擇標記是______________。

（4）基因P表達的蛋白P是脯氨酸合成過程所需的一種關鍵酶，而脯氨酸在細胞中的積累既可提高植物的抗旱性，又可抑制蛋白P的酶活性。研究發現，蛋白P的第128位苯丙氨酸若變為丙氨酸，該抑制作用則顯著降低。請據此提出進一步提高植物抗旱性的一種簡要思路______________。

Answer 1

【答案】不需要 使用基因特異性引物可以從模板DNA中擴增出特定基因 重組質粒（重組DNA分子） 基因P和質粒反向連接 潮霉素抗性基因 定點誘變改造目的基因P，使其編碼的蛋白P的第128位苯丙氨酸替換為丙氨酸；將改造后的基因轉入受體植物，以期提高受體植物的抗旱性

【解析】

基因工程的基本操作步驟主要包括四步：①目的基因的獲取；②基因表達載體的構建；③將目的基因導入受體細胞；④目的基因的檢測與表達。從分子水平上檢測目的基因的方法：（1）分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。

（1）使用基因特異性引物可以從模板DNA中擴增出位于兩個引物之間的特定基因序列，無需限制酶預先切取模板。

（2）目的基因和質粒載體的連接物稱為重組質粒或者重組DNA分子。用同一種限制酶對含有目的基因的DNA和質粒進行單酶切，因為獲得的末端相同，所以容易造成目的基因或質粒自身環化、目的基因和質粒反向連接。

（3）MS培養基中添加潮霉素進行篩選，由此可見，質粒載體攜帶的標記基因是潮霉素抗性基因。

（4）蛋白P的第128位苯丙氨酸若變為丙氨酸，脯氨酸抑制蛋白P的酶活性的作用則顯著降低。但是，如何將蛋白P的第128位苯丙氨酸變為丙氨酸，這就必須從根本上相應地改造抗旱目的基因P，將改造后的基因轉入受體植物，以期提高受體植物的抗旱性。