Question

【題目】現有重組質粒甲（共含2686個堿基對，不含T-DNA）和乙，為避免基因反接，研究人員用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割重組質粒甲、乙，再利用所得片段構建了重組質粒丙（下圖所示），然后采用農桿菌轉化法將丙導入胡蘿卜愈傷組織細胞。培養后得到轉VP1基因胡蘿卜植株。請回答：

（1）構建重組質粒丙的目的是將VP1基因插入到________中，從而使VP1基因進入植物細胞后，能整合到染色體的DNA上。利用重組質粒甲、乙構建丙的過程中，用到的工具酶是____________。

（2）將重組質粒甲、乙和丙進行分組，每組只含其中一種重組質粒，同時用限制酶Ⅰ和Ⅱ切割，結果如下表所示：

組別	切割后所得DNA片段的情況
第1組	只得到含有2146和540個堿基對的2種DNA片段
第2組	只得到含有540和12400個堿基對的2種DNA片段
第3組	只得到含有12400和1000個堿基對的2種DNA片段

切割前，重組質粒甲含有______個游離的磷酸基團，限制酶Ⅰ在重組質粒甲中有________個切割位點，表中第_________組是切割重組質粒丙的結果。

（3）在植物組織培養過程中需要無菌操作，因此對外植體（離體的組織塊）要進行_____處理。用于培養外植體的培養基不適用于培養胚狀體，原因是_________________________。

Answer 1

【答案】T-DNA 限制酶Ⅰ、Ⅱ和DNA連接酶 0 1 2 消毒 培養基中添加的植物激素（植物生長調節劑）的種類和含量比例有所不同

【解析】

基因工程的基本操作程序包括：目的基因的獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。①目的基因的獲取方法：從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增、通過DNA合成儀人工合成。②基因表達載體由目的基因、啟動子、終止子、標記基因等組成。③將目的基因導入動物細胞通常利用顯微注射技術；將目的基因導入植物細胞通常用農桿菌轉化法，此外還有基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入微生物細胞通常用感受態細胞法。④目的基因的檢測與鑒定分為分子水平和個體水平，前者包括DNA分子雜交、分子雜交、抗原—抗體雜交法，后者進行個體水平檢測如抗蟲抗病接種實驗。

（1）T-DNA可轉移至受體細胞并整合到受體細胞染色體的DNA上，由圖示可知，重組質粒甲上有目的基因VP1，沒有T-DNA，重組質粒乙上含有T-DNA，因此構建重組質粒丙的目的是將VP1基因插入到T-DNA中，從而使VP1基因進入植物細胞后，能整合到染色體的DNA上，使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達。構建重組質粒過程需要用到的工具酶有限制酶Ⅰ、Ⅱ和DNA連接酶。

（2）重組質粒甲屬于環狀DNA分子，含2686個堿基對，在切割前含有0個游離的磷酸基團。由于每組只含其中一種重組質粒，重組質粒丙由重組質粒甲、乙拼接而成，根據表格中切割后的片段堿基數可推得，第1組為重組質粒甲、第2組為重組質粒丙、第3組為重組質粒乙，由于第1組重組質粒甲被限制酶Ⅰ、Ⅱ切割后只得到含有2146和540個堿基對的2種DNA片段，則限制酶Ⅰ在重組質粒甲中只有1個切點。

（3）在植物組織培養過程中需要無菌操作，因此對外植體要進行消毒處理。用于培養外植體的培養基不適用于培養胚狀體，原因是培養基中添加的植物激素的種類和含量比例有所不同，前者利于脫分化形成愈傷組織，后者利于再分化形成胚狀體。