Question

【題目】人體內的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和腦血栓的急救藥。然而，為心梗患者注射大劑量的t-PA會誘發顱內出血，其原因在丁t-PA作用的特異性不高。研究證實，將t-PA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低出血副作用。

(1)依據所需t-PA蛋白的結構和功能，對天然的t-PA基因進行序列改造，可制造出性能優異的t-PA突變蛋白，該技術稱為_______________。

(2)已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板鏈序列為ACA，而絲氨酸的密碼子為UCU，因此突變基因編碼該氨基酸的模板鏈序列應設計為______________。

(3)若獲得的t-PA突變基因如下圖所示，那么質粒pCLY11需用_______________兩種限制酶切開，才能與t-PA突變基因高效連接。

(4)將連接成功的基因表達載休導入大腸桿菌中，在含有___________的培養基上挑選顏色呈____________的菌落，初步篩選導入成功的細胞。

(5)檢測t-PA突變基因是否導入大腸桿菌，可利用t-PA突變基因制備探針，進行_______________，檢測是否有雜交鏈；也可依據t-PA突變基因兩端的序列設計引物對大腸桿菌的DNA進行PCR擴增，若出現了_______________說明t-PA突變基因已經導入了受體細胞。

(6)在上述步驟成功的基礎上，若沒有能從大腸桿菌中提取到相應的t-PA突變蛋白，其可能的原因是________________。

Answer 1

【答案】蛋白質工程 AGA XmaⅠ和BglⅡ 新霉素 白色 DNA分子雜交 擴增產物（子代DNA） 目的基因的轉錄或翻譯異常

【解析】

1、蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產自然界已存在的蛋白質）

2、蛋白質工程的基本途徑：從預期的蛋白質功能出發，設計預期的蛋白質結構，推測應有的氨基酸序列，找到相對應的脫氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白質工程特有的途徑；以下按照基因工程的一般步驟進行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）

（1）通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需求，該技術成為蛋白質工程。

（2）因為制造性能優異的t-PA突變蛋白，是將t-PA第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的編碼序列（即模板鏈的互補鏈序列）為ACA，而絲氨酸的密碼子為UCU，因此突變基因編碼該氨基酸的編碼序列應設計為AGA。

（3）由于目的基因的兩端的堿基序列分別是CCGG、CTAG，所以應用XmaI和BglII兩種限制酶切割，以便于把目的基因連接到質粒pCLY11上。

（4）由圖1可知，將連接好的DNA分子導入大腸桿菌中，由于限制酶切割質粒破壞了mlacZ基因，所以含t-PA突變基因重組DNA分子的細胞應具有的表型是新霉素抗性且呈白色，所以可以在含新霉素的培養基上挑選白色的菌落。

（5）檢測目的基因是否倒入受體細胞可以用t-PA突變基因制備探針，進行DNA分子雜交；也可以依據t-PA突變基因兩端的序列設計引物對大腸桿菌的DNA進行PCR擴增，如果出現子代DNA分子，說明已經倒入受體細胞。

（6）如果已經檢測到基因，但沒有相關的蛋白質，蛋白質的合成需要經過轉錄和翻譯，所以可能原因是目的基因沒有轉錄和翻譯。