Question

【題目】某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發下會發出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5’末端，獲得了Ll-GFP融合基因，并將其插入質粒P0，構建了真核表達載體Pl，其部分結構和酶切位點如下圖所示，圖中El～E4四種限制酶產生的黏性末端各不相同。回答下列問題：

(l)該團隊在將Ll-GFP融合基因插入質粒P0時，使用了兩種限制酶，據圖推斷它們是____。使用這兩種酶進行酶切是為了保證____，也是為了保證____的正確連接。

(2)為獲得含有LI-GFP融合基因的牛，可將能夠產生綠色熒光細胞的細胞核植入牛的____中，再進行體外培養、胚胎移植等相關操作。若采用胚胎分割移植技術一次獲得多頭表型相同的轉基因牛，在對處于囊胚階段的胚胎進行分割時，應注意____。

(3)為檢測Ll-GFP融合基因是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定。在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的 ___作為PCR模板。利用PCR技術進行DNA擴增時，除模板外，還必須提供的物質是 __。

Answer 1

【答案】E1和E4 Ll-GFP融合基因的完整 Ll- GFP融合基因與載體 去核卵母細胞 內細胞團均等分割 核DNA 與模板鏈結合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）要保證目的基因在受體細胞中能夠正確表達，目的基因的首端應有啟動子，尾端應有終止子。甲是將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5ˊ末端而獲得的L1-GFP融合基因，據此結合題意并分析圖示可知：該團隊在將甲插入質粒P0時，如果用E2或E3，則目的基因不完整，而使用E1和E4這兩種限制酶進行酶切保證了甲的完整，而且也保證了甲與載體正確連接，因此，使用的兩種限制酶，是E1和E4。

（2）若要獲得含有甲的牛，可采用核移植技術，即將能夠產生綠色熒光細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中獲得重組細胞，并將該重組細胞在體外培養成重組胚胎，再經過胚胎移植等獲得含有甲的牛，若采用胚胎分割移植技術一次獲得多頭表型相同的轉基因牛，在對處于囊胚階段的胚胎進行分割時，應注意內細胞團均等分割。

（3）PCR是多聚酶鏈式反應的縮寫，是一種在生物體外復制特定DNA片斷的核酸合成技術。若利用PCR方法檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，則應分別以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板，用PCR技術進行DNA擴增時，除模板外，還必須提供的物質是與模板鏈結合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶。