Question

【題目】人乳鐵蛋白是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白。乳鐵蛋白不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且具有廣譜抗菌抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等強(qiáng)大生物功能。如圖是培育表達(dá)人乳鐵蛋白的乳腺生物反應(yīng)器的過程。圖中tetR表示四環(huán)素抗性基因，ampR表示氨芐青霉素抗性基因，BamHI、HindⅢ、SmaI直線所示為三種限制酶的酶切位點(diǎn)。據(jù)圖回答：

（1）若用PCR技術(shù)擴(kuò)增人乳鐵蛋白基因，其前提條件是有一段____________，以便合成相應(yīng)的引物，合成的引物能與待擴(kuò)增區(qū)段____________（中間/兩端/左端/右端）的DNA序列彼此互補(bǔ)。

（2）圖中將人乳鐵蛋白基因插入載體，需用____________限制酶同時(shí)酶切載體和人乳鐵蛋白基因。篩選含有重組載體的大腸桿菌首先需要在含____________的培養(yǎng)基上進(jìn)行。經(jīng)過兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)后再從____________處（填字母），挑出大腸桿菌擴(kuò)增帶有外源DNA的重組載體。為使人乳鐵蛋白基因在牛的乳腺細(xì)胞中特異性表達(dá)，應(yīng)在基因的上游插入____________。

（3）過程②的代孕牛需要進(jìn)行____________處理。若需獲得多頭轉(zhuǎn)基因牛可對早期胚胎進(jìn)行分割，對囊胚進(jìn)行分割時(shí)需要注意____________。

（4）為檢測轉(zhuǎn)基因牛的乳汁中是否含有人乳鐵蛋白，可采用____________技術(shù)。

Answer 1

【答案】人乳鐵蛋白基因（目的基因）的核苷酸序列 兩端 HindⅢ和 Bam H I 氨芐青霉素 D 牛乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件 同期發(fā)情 將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割 抗原抗體雜交

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：

分子水平上的檢測：

①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；

②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；

③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。

個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提條件是有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成相應(yīng)的引物，引物是成對存在，能與待擴(kuò)增區(qū)段兩端的DNA序列彼此互補(bǔ)。

（2）由圖可知，人乳鐵蛋白基因兩端及載體都有HindⅢ和 Bam H I限制酶切點(diǎn)，故要將人乳鐵蛋白基因插入載體，需用HindⅢ和 Bam H I限制酶同時(shí)酶切載體和人乳鐵蛋白基因。重組載體的四環(huán)素抗性基因已破壞，標(biāo)記基因只有氨芐青霉素抗性基因，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上篩選含有重組載體的大腸桿菌。含有重組載體大腸桿菌能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，但不能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長，故經(jīng)過兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)后再從D處選出所需大腸桿菌。為使人乳鐵蛋白基因在牛的乳腺細(xì)胞中特異性表達(dá)，應(yīng)在基因的上游插入牛乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件。

（3）為使供受體處于相同的生理狀態(tài)，過程②的代孕牛需要進(jìn)行同期發(fā)情處理。對囊胚進(jìn)行分割時(shí)需要注意將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割。

（4）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)可采用抗原-抗體雜交技術(shù)。