Question

【題目】金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在的金屬結合蛋白。某研究小組計劃通過多聚酶鏈式反應（PCR）擴增獲得目的基因，構建轉基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴增過程示意圖圖像，請回答下列問題：

（1）從高表達MT 蛋白的生物組織中提取mRNA，通過______________獲得cDNA用于PCR擴增。

（2）設計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物（引物1和引物2），為方便構建重組質粒，在引物中需要增加適當的限制性核酸內切酶位點。設計引物時需要避免引物之間形成______________，而造成引物自連。

（3）圖中步驟1代表____________________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環。

（4）PCR擴增時，退火溫度的設定是成敗的關鍵。退火溫度過高會破______________的堿基配對。退火溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，長度相同但______________的引物需要設定更高的退火溫度。

（5）如果PCR反應得不到任何擴增產物，則可以采取的改進措施有______________（填序號：①升高退火溫度 ②降低退火溫度 ③重新設計引物）。

Answer 1

【答案】逆轉錄 堿基互補配對 變性 引物與模板 GC含量高 ②③

【解析】

PCR技術：
1、概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術。
2、原理：DNA復制。
3、前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物。
4、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）。
5、過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復性：引物結合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈；PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開。

（1）PCR擴增目的基因，首先要有目的基因作為模板，所以從高表達MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉錄獲得cDNA，從而用于PCR擴增。

（2）構建重組質粒，首先要用限制酶切割含目的基因的DNA片段和質粒，所以位于目的基因兩端的引物中需要增加適當的限制性核酸內切酶位點，設計的引物之間不能有堿基互補配對，否則引物自連，而不能與模板相連。
（3）圖中步驟1、2、3分別代表變性、退火、延伸，這三個步驟組成一輪循環。
（4）退火表示引物與模板相連，若退火溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對；由于G-C之間有三個氫鍵，A-T之間有兩個氫鍵，所以G-C含量越高的引物，退火溫度越高。
（5）PCR反應得不到任何擴增產物，可能是退火溫度過高，導致引物與模板不能相連或引物間相互配對，引物自連，不能與模板相連，因此，可通過②降低退火溫度或③重新設計引物進行改進。