Question

【題目】CRISPR/Cas9系統基因編輯技術是近年來頗受關的一項新技術。該基因表達系統主要包含引RNA和Cas9蛋兩個部分，引導RNA能識別并結合特定的DNA序列，從而引導Cas9蛋白結合到相應位置并剪切DNA，最終實現對靶基因序列的編輯。研究人員試圖CRISPR/Cas9系統對水稻產量基因Q基因進行編輯，請回答下列問題：

（1）研究發現，CRISPR/Cas僅存在于原核生物，故需借助__________技術才能在水稻細胞中發揮作用。Cas9蛋白與__________酶的功能相似。

（2）首先依據__________的部分序列設計DNA片段A（負責編碼相應引導RNA），再將片段A與含有Cas9基因的質粒B連接，以構建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統基因達載體（如圖所示），該過程中需要用到的兩類工具酶有________________。

（3）質粒B大小為2．5kb（位點Ⅰ與位點Ⅱ相隔60b），經酶切后的片段A大小為0．5kb（千堿基對），連接形成的表達載體大小為__________kb。

（4）常用農桿菌轉化法將目的基因導入水稻受體細胞，依據農桿菌的侵染特點，目的基因將插入到Ti質粒的__________上，經過轉化作用，進入水稻細胞，并將其插入到__________，從而使其得以維持穩定和表達。

（5）CRISRP/Cas基因編輯技術有時存在編輯對象出錯而造成脫靶，試從引導RNA的角度分析脫靶的原因____________________。

Answer 1

【答案】轉基因（DNA重組或基因工程） 限制酶 Q基因 限制酶和DNA連接酶 2.94kb T-DNA 水稻細胞染色體的DNA.上 其他DNA序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結合而脫靶

【解析】

1.基因工程的工具：

（1）限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。

（2）DNA連接酶：連接的是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

（3）運載體：常用的運載體：質粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒。

2.將目的基因導入受體細胞的方法有：

將目的基因導入植物細胞：采用最多的方法是農桿菌介導轉化技術(農桿菌轉化法)，其次還有基因槍法和花粉管通道技術(花粉管通道法)。

將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是顯微注射技術。此方法的受休細胞多為受精卵；將目的基因導入微生物細胞： Ca2+處理法。

（1）由于CRISPR/Cas僅存在于原核生物，若要讓CRISPR/Cas在真核細胞中起作用，需借助基因工程技術將其轉入水稻細胞中才能發揮作用。根據題干信息"Cas9蛋白結合到相應位置并剪切DNA"，說明Cas9蛋白與限制酶的功能相似。

（2）由于是對水稻產量基因Q基因進行編輯，故首先需要依據Q基因的部分序列設計DNA片段A （負責編碼相應引導RNA），再將片段A與含有Cas9基因的質粒B連接，以構建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統基因表達載體。構建基因表達載體需要用到限制酶和DNA連接酶。

（3）質粒B大小為2. 5kb (位點l與位點lI相隔60b)，經酶切后的片段A大小為0.5kb (千堿基對)，連接形成的表達載體大小為2.5+0.5-0.06=2.94kb。

（4）常用農桿菌轉化法將目的基因導入水稻受體細胞，由于農桿菌的Ti質粒的T-DNA可轉移至受體細胞，并整合到受體細胞的染色體DNA上，故可將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上，經過轉化作用，進入水稻細胞，并將其插入到水稻細胞染色體的DNA上，從而使其得以維持穩定和表達。

（5）由于其他DNA序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結合，從而導致CRISRP/Cas9基因編輯技術會出現編輯對象出錯而造成脫靶。