Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細胞因子，廣泛用于動物領域的抗病毒治療。科研人員將雞干擾素基因作為目的基因，構建基因表達載體，通過農桿菌介導法導入煙草，以獲得抗病毒煙草。下圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細胞的流程，①～④表示相關的操作，兩種限制酶的識別序列及切割位點如表所示。請回答下列問題：

（1）步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據是__________的特定堿基排列順序。科研人員還在兩種引物的一端分別加上了__________和___________（填DNA序列），以便于后續的剪切和連接。為防止酶切產物自身環化，構建表達載體需用兩種限制酶，選擇的原則是_________。

A．Ti質粒內，限制酶的切割位點應位于T-DNA內

B．目的基因編碼蛋白質的序列中，每種限制酶只有一個切割位點

C．酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列不相同

D．酶切后，Ti質粒形成的兩個黏性末端序列相同

（2）步驟②所構建的基因表達載體中未標注出的元件還可以有____________，步驟③中需先用____________處理農桿菌以便將基因表達載體導入細胞。

（3）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細胞的RNA后，先通過_________獲得DNA，再進行PCR擴增，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是①________________________②_____________________________。

Answer 1

【答案】雞干擾素基因 GAATTC GGATCC AC 復制原點 鈣離子 逆轉錄 雞干擾素基因未導入愈傷組織細胞 導入后未轉錄出mRNA

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成；

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法；

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）步驟①中，利用PCR技術擴增雞干擾素基因時，引物應可以和雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列進行堿基互補配對，因此，需要根據雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列來設計引物的堿基序列。據圖可知，該轉基因過程用EcoR I和BamH I兩種限制酶分別切割目的基因和質粒，以避免質粒或目的基因的自身連接，應在兩種引物的一端分別加上EcoR I和BamH I的識別序列GAATTC和GGATCC，以便于后續的剪切和連接。為防止酶切產物自身環化，構建表達載體需用兩種限制酶，選擇的原則為：

A、限制酶的切割位點應位于Ti質粒的T-DNA內，這樣能保證目的基因插入到T-DNA中，而后目的基因可隨著T-DNA進入受體細胞的染色體DNA中，A正確；

B、目的基因編碼蛋白質的序列中不能有種限制酶的切割位點，否則，達不到轉基因的目的，B錯誤；

C、酶切后，目的基因需要形成兩個不相同黏性末端，這樣能避免自身環化，C正確；

D、酶切后，Ti質粒形成的兩個黏性末端序列也不能相同，否則會自身環化，D錯誤。

故選AC。

（2）基因表達載體中除含有啟動子、終止子、標記基因、目的基因和復制原點。據此可知，步驟②所構建的基因表達載體中未標注出的元件還可以有復制原點，復制原點的存在，可以保證目的基因在宿主細胞中復制，步驟③為導入受體細胞，這里的受體細胞是土壤農桿菌，在將基因表達載體導入農桿菌之前，可用鈣離子處理農桿菌，以增大細胞壁通透性，提高轉化效率。

（3）步驟④為目的基因的檢測與鑒定，在該過程中，科研人員首先提取愈傷組織細胞的RNA，然后通過逆轉錄獲得DNA，再進行PCR擴增，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因為：①雞干擾素基因即便導入了農桿菌，也不一定能導入煙草愈傷組織細胞；②導入煙草愈傷組織細胞的雞干擾素基因不一定能夠正常轉錄，也可能為轉錄出的雞干擾素的mRNA若被水解, 則不能通過逆轉錄獲得雞干擾素基因。