Question

【題目】為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與質粒（圖2）重組，再借助農桿菌導入菊花中。請回答問題：

（1）科學家是利用RT-PCR技術（mRNA逆轉錄為cDNA再進行PCR擴增），獲得花色基因C，RT-PCR過程需要的酶有_____。在進行PCR擴增時需要設計___種引物。

（2）將基因C與質粒（圖2）重組，需要用到的酶有_____。本實驗中，對質粒進行酶切時，只能單一酶切，不能雙酶切，原因是____________________。與雙酶切相比，單一酶切存在的缺點是________________（答出兩點）。

（3）把重組質粒導入菊花細胞中，借助了農桿菌，選用農桿菌的原因是___________。

（4）在實驗操作過程中，篩選被轉化的菊花細胞應在培養基中添加_________。如要檢測基因C是否整合到菊花染色體的DNA上，應采用__________技術。

Answer 1

【答案】逆轉錄酶和Taq酶（熱穩定的DNA聚合酶） 2 EcoRI和DNA連接酶 基因C只有EcoRI的酶切位點，當質粒被同一種酶切割后產生同樣的末端，基因C才能和質粒連接成環狀 目的基因會自身連接、載體會自身連接、目的基因與運載體反向連接（任意兩點） 能感染菊花細胞、農桿菌的Ti質粒上的T-DNA可以轉移至菊花細胞，且能整合到菊花細胞染色體DNA上 潮霉素 DNA分子雜交

【解析】

1、有關PCR技術的相關知識：

（1）概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術。

（2）原理：DNA復制。

（3）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物。

（4）過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復性：引物結合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開。

2、基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA—分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）根據題意可知，RT-PCR技術是mRNA逆轉錄為cDNA再進行PCR擴增的過程，其中逆轉錄過程需要逆轉錄酶，而PCR技術需要Taq酶（熱穩定的DNA聚合酶）的催化。在進行PCR擴增時需要設計兩種引物。

（2）將基因C與質粒重組，需要用到的酶有EcoRI和DNA連接酶。本實驗中，對質粒進行酶切時，只能單一酶切，不能雙酶切，原因是基因C只有EcoRI的酶切位點，當質粒被同一種酶切割后產生同樣的末端，基因C才能和質粒連接成環狀。與雙酶切相比，單一酶切存在的缺點是目的基因會自身連接、載體會自身連接、目的基因與運載體反向連接。

（3）借助了農桿菌把重組質粒導入到植物細胞，因為農桿菌能感染菊花細胞、農桿菌的Ti質粒上的T-DNA可以轉移至菊花細胞，且能整合到菊花細胞染色體DNA上。

（4）圖2中顯示標記基因是潮霉素抗性基因，因此可在培養基中添加潮霉素，篩選被轉化的菊花細胞。檢測目的基因是否導入受體的細胞常用DNA分子雜交技術。