Question

【題目】P450是石油降解的關(guān)鍵酶，用SalⅠ和NdeⅠ聯(lián)合酶切獲得的P450基因，與下圖所示的質(zhì)粒（pCom8）重組，導(dǎo)入土著菌種Y9，獲得了基因工程菌P450/Y9。圖中mel是黑色素合成基因，該基因表達(dá)能使白色的菌落變成黑色，aacCl是慶大霉素（一種抗生素）抗性基因，限制酶NdeⅠ、XhoⅠ和SspⅠ在該質(zhì)粒上均只有一個(gè)酶切位點(diǎn)。下表表示幾種限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，據(jù)圖回答下列問(wèn)題：

限制酶	SalⅠ	Nde Ⅰ	Xho Ⅰ	Ssp Ⅰ
識(shí)別序列及切割位點(diǎn)

（1）構(gòu)建pCom8重組質(zhì)粒時(shí)，需要用__________________________（限制酶）對(duì)圖示質(zhì)粒進(jìn)行處理，才能與__________________________在DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒。基因工程中用兩種不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，獲得不同的黏性末端的主要目的是防止_________________________和反向連接。

（2）為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入用__________預(yù)先處理的土著菌種Y9中，提高質(zhì)粒導(dǎo)入率，以便獲得更多基因工程菌P450/Y9。為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的基因工程菌P450/Y9，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加______________。作為載體的質(zhì)粒除了含有標(biāo)記基因，還應(yīng)該含有____________________（至少寫(xiě)兩個(gè)）。

（3）為檢測(cè)基因工程菌降解石油能力的大小，可觀測(cè)的指標(biāo)是____________________________。土著菌種Y9不能降解石油，但轉(zhuǎn)入上述構(gòu)建好的表達(dá)載體后則獲得降解石油的能力，這是因?yàn)?/span>________________。

Answer 1

【答案】Nde Ⅰ、Xho Ⅰ 目的基因（或P450基因） 目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化 Ca2+（或CaCl2） 慶大霉素 啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn) 2天后（或一定時(shí)間后）樣品中石油的含量（剩余量） 基因工程菌P450/Y9能分泌降解石油的P450酶

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

1、目的基因的獲取：方法有從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

3、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

4、目的基因的檢測(cè)與鑒定：

（1）分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。

（2）個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）根據(jù)題干信息已知，切割目的基因的限制酶是SalⅠ和NdeⅠ，而SalⅠ切割質(zhì)粒會(huì)破壞標(biāo)記基因，又因?yàn)橐覉D顯示SalⅠ和XhoⅠ切割后露出的黏性末端是相同的，因此可以用NdeⅠ、XhoⅠ切割質(zhì)粒，然后與目的基因在DNA連接酶的作用下形成重組質(zhì)粒。基因工程中用兩種不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，獲得不同的黏性末端的主要目的是防止目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化以及目的基因和質(zhì)粒反向連接。

（2）為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入用Ca2+（或CaCl2）處理變得處于感受態(tài)的的微生物中。質(zhì)粒中含有aacCl是慶大霉素（一種抗生素）抗性基因，因此在篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的基因工程菌P450/Y9，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加慶大霉素。作為載體的質(zhì)粒一般具有啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)等條件。

（3）導(dǎo)入了目的基因P450基因的工程菌具備了降解石油的能力，可通過(guò)觀察一定時(shí)間后樣品中石油的含量來(lái)檢測(cè)該菌株降解石油的能力。土著菌種Y9不能降解石油，但轉(zhuǎn)入上述構(gòu)建好的表達(dá)載體后，基因工程菌P450/Y9能分泌降解石油的P450酶，因而獲得了降解石油的能力。