Question

【題目】發根農桿菌的Ri質粒是一種植物遺傳轉化系統，其有3個功能區：①T-DNA區是Ri質粒上唯一整合到植物基因組上的DNA片段；②Vir毒性蛋白區是發根農桿菌實現高效侵染所必需的區域；③Ori區即復制起始區與功能代謝區。常用的質粒載體pCAMBIA1301在大腸桿菌和發根農桿菌中都能生存和克隆，并且自身攜帶潮霉素抗性基因以及可以替換T-DNA的DNA片段，經處理后質粒pCAMBIA1301也可具備T-DNA。部分轉化過程如圖所示。

請回答下列問題：

（1）限制性核酸內切酶能識別圖中LB和RB的酶切位點，并能使1個pCAMBIA1301質粒的_____個磷酸二酯鍵斷開。

（2）應用過程中，將目的片段插入到pCAMBIA1301質粒的_______________中，再將構建好的重組質粒轉入發根農桿菌細胞中。要確定重組質粒是否被成功導入發根農桿菌，可在培養發根農桿菌一段時間后，利用pCAMBIA1301上自身攜帶的_____________進行鑒定，也可利用基因探針通過_________________技術進行檢測。

（3）可分別用70%乙醇和_________________溶液浸泡處理植物組織，并使其脫分化形成愈傷組織，再用重組發根農桿菌對其進行侵染，之后進行脫菌培養，然后以適當配比的________________________誘導，最終可獲得轉基因植株。

（4）圖中Ri質粒上的T-DNA片段有缺損，因此無法被轉化至植物細胞內，但Ri質粒上的__________仍可對侵染過程起到輔助激活作用。若Ri質粒結構完整，其功能類似于根瘤農桿菌中的_______________。

Answer 1

【答案】4 T-DNA 潮霉素抗性基因 DNA分子雜交 5%次氯酸鈉 營養物質和生長調節劑 Vir毒性蛋白區 Ti質粒

【解析】

基因工程的操作步驟：

1.目的基因的獲取方法：（1）從基因文庫中獲取；（2）PCR擴增技術；（3）人工合成法。

2. 基因表達載體的構建：①過程：用同一種限制酶切割目的基因和運載體，再用DNA連接酶將目的基因和運載體連接形成重組DNA分子。②目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在并且可以遺傳給下一代并表達和發揮作用。③基因表達載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因。

（1）啟動子在基因的首段，它是RNA聚合酶的結合位點，能控制著轉錄的開始；

（2）終止子在基因的尾端，它控制著轉錄的結束；

（3）標記基因便于目的基因的鑒定和篩選。

3.將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（1）農桿菌的特點：在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有感染能力。農桿菌的Ti質粒上的T－DNA可轉移到受體細胞，并且整合到染色體的DNA上。根據這一特點，如果將目的基因轉移到Ti質粒的T－DNA上，通過農桿菌的轉化作用，可以使目的基因進入植物細胞，并將其插入到植物細胞染色體的DNA上。

4.目的基因的檢測與鑒定：（1）分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術．（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）限制酶能夠識別雙鏈DNA分子某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，因此限制性核酸內切酶能識別圖中LB和RB的酶切位點，在pCAMBIA1301質粒上切2個切口，使1個pCAMBIA1301質粒的4個磷酸二酯鍵斷開。

（2）根據題意可知，經處理后質粒pCAMBIA1301也可具備T-DNA，將目的基因插入到T-DNA中，可以在T-DNA的作用下轉移到受體細胞內染色體的DNA上，要確定重組質粒是否被成功導入發根農桿菌，可在培養發根農桿菌一段時間后，pCAMBIA1301上自身攜帶的潮霉素抗性基因屬于標記基因，標記基因的作用是可以對重組DNA進行鑒定和選擇，也可在分子水平上利用基因探針通過DNA分子雜交技術，根據雜交帶的有無進行檢測發根農桿菌細胞內的DNA上有無目的基因的存在。

（3）在植物組織培養過程中，對外植體可分別用70%乙醇和5%次氯酸鈉溶液浸泡處理，并使其脫分化形成愈傷組織，再用重組發根農桿菌對其進行侵染，之后進行脫菌培養，然后以適當配比的營養物質和生長調節劑（生長素類和細胞分裂素類）誘導，最終可獲得轉基因植株。

（4）根據題意可知，圖中Ri質粒上有3個功能區：①T-DNA區是Ri質粒上唯一整合到植物基因組上的DNA片段；②Vir毒性蛋白區是發根農桿菌實現高效侵染所必需的區域；③Ori區即復制起始區與功能代謝區。如果Ri質粒上的T-DNA片段有缺損，因此無法被轉化至植物細胞內，但Ri質粒上的Vir毒性蛋白區是發根農桿菌實現高效侵染所必需的區域，仍可對侵染過程起到輔助激活作用。若Ri質粒結構完整，其功能類似于根瘤農桿菌中的Ti質粒。