Question

【題目】下圖1是獲取用于構建基因表達載體的含人生長激素基因的DNA片段(DNA復制子鏈延伸方向是5′→3′，轉錄方向為左→右)示意圖，圖2是所用質粒示意圖，其上的Ampr表示青霉素抗性基因，Tett表示四環素抗性基因。有關限制酶的識別序列和酶切位點如下表。請據圖回答：

限制酶識別序列和酶切位點表

限制酶	HindⅢ	BamHⅠ	PstⅠ	EcoRⅠ	SmaⅠ	BglⅡ
識別序列(5′→3′)	A↓AGCTT	G↓GATCC	C↓TGCAG	G↓AATTC	CCC↓GGG	A↓GATCT

(1) ①過程催化形成磷酸二酯鍵的酶有____________________，合成的人生長激素基因中________(選填“有”或“無”)與終止密碼子相應的堿基序列。

(2) 引物1由5′→3′的堿基序列為________________________，引物2應含有限制酶________的識別序列；從圖1的過程②開始進行PCR擴增，第六次循環結束時，圖中用于構建基因表達載體的DNA片段所占比例是________。

(3) 在構建表達載體的過程中對圖中質粒、DNA片段進行合適的完全酶切后，向兩者的混合物中加入DNA連接酶，若只考慮DNA切段兩兩連接，則混合物中將形成________種環狀DNA。

(4) 2018年11月基因編輯嬰兒事件震驚了世界，輿論一片嘩然，某科研團隊利用“CRISPR/Cas9”技術將受精卵中的艾滋病病毒受體基因CCR5進行修改，擬培育出具有艾滋病免疫能力的基因編輯嬰兒。下圖3為向導RNA引導Cas9蛋白切割CCR5基因(目標DNA)示意圖。

①向導RNA的合成需要________酶。Cas9蛋白是一種________酶。

②“GRISPR/Cas9”技術，是利用________法將Cas9蛋白和特定的引導序列導入受精卵中發揮基因編輯作用。

③基因編輯嬰兒引起輿論的關注，很多科學家表示反對，請給出合理的理由______________。

Answer 1

【答案】反轉錄酶和DNA聚合酶 有 AGATCTGCATCCTCCAGG BamHⅠ 13/16 6 RNA聚合 限制 顯微注射 細胞內DNA上可能不止一個Cas9酶識別和切割位點，可能導致脫靶

【解析】

據圖2可推知，引物1序列應包含5′-GCATCCTCCAGG-3′，引物2序列應包含5′TAGAGGGACTAC-3′，合成目的基因后需要用限制酶切割，由于目的基因中含有HindⅢ、PstⅠ切點，故用于構建基因表達載體時可選擇的酶只剩下BglⅡ、BamHⅠ、EcoRⅠ，為防止自身環化等情況出現，則應選擇兩種酶切割，故應選擇的酶為BglⅡ、BamHⅠ，最終設計的引物應在兩端加上特定的酶切位點，以便將合成的目的基因完整的切割下來。

（1）①過程表示逆轉錄過程，催化形成磷酸二酯鍵的酶有逆轉錄酶和DNA聚合酶，合成的人生長激素基因中有與終止密碼子相應的堿基序列。

（2）據分析可知，引物1序列含GCATCCTCCAGG，引物2序列含TAGAGGGACTAC，在設計引物時，應在引物1的5′加上BglⅡ的酶切序列，在引物2的5′加入BamHⅠ酶切序列，因此引物1由5′→3′的堿基序列為AGATCTGCATCCTCCAGG，引物2應含有限制酶BamHⅠ的識別序列；從圖1的過程②開始進行PCR擴增，第六次循環結束時，根據圖示和PCR擴增技術的特點，可以推導出共有6個DNA的序列雙鏈不等長，故圖中可用于構建基因表達載體的DNA片段所占比例是1-6/26=13/16。

（3）在構建表達載體的過程中對圖中質粒、DNA片段進行合適的完全酶切后，形成的含有2個酶切位點的片段有3種，向兩者的混合物中加入DNA連接酶，若只考慮DNA切段兩兩連接，則混合物中將形成6種環狀DNA。

（4）①向導RNA的合成需要RNA聚合酶。Cas9蛋白能切割CCR5基因，故Cas9蛋白是一種限制性核酸內切酶。

②將外源基因導入受精卵中應選擇顯微注射法，故“GRISPR/Cas9”技術，是利用顯微注射法將Cas9蛋白和特定的引導序列導入受精卵中發揮基因編輯作用。

③基因編輯嬰兒引起輿論的關注，很多科學家表示反對，原因是細胞內DNA上可能不止一個Cas9酶識別和切割位點，可能導致脫靶；此外，還存在其他的風險和違背當前的倫理道德。