Question

【題目】人們對富含纖維素的木材廢料、廢紙、農作物殘渣等進行簡單堆積或焚 燒，不僅浪費資源而且污染環境。研究人員將放線菌的纖維素酶基因導入大腸桿 菌體內，構建高表達纖維素酶的工程菌，提高纖維素降解效率，降低成本且環保。 請回答問題：

（1）在富含 ____的土壤中采集土樣，放入培養基中培養一段時間后，利用 ____ 法將菌液接種篩選培養基上。培養一段時間后，挑取不同形態、顏色的 ____ 進行分離及純化，獲得純培養物。再接種到篩選鑒定培養基上，培養觀察、 測量并記錄 ____，結果如下表：

菌株名稱	菌落直徑（cm）	降解圈直徑（cm）
D1	1.75	2.6
D3	1.90	2.7
D4	1.50	2.2
H1	1.16	2.3
H2	1.15	1.8
Lb1	0.45	1.4

由表可知菌株____為目標菌株，降解纖維素能力最強。

（2）為獲取纖維素酶高表達的工程菌，進行下列實驗操作。

①從目標菌株中獲取____，研究發現目標菌株內與產纖維素酶有關的基因共有 3 種，其中有兩種基因已研究并被命名，選取未被命名的且標識為 5676的基因（長度為 1044 bp）進行克隆并使其在大腸桿菌中得到表達。

②選取質粒 p 構建纖維素酶重組表達載體（ p-5676），____ 到大腸桿菌 DH5α，在抗性培養基過夜培養，抽提質粒經過 Nde I 和 Kpn I 雙酶切驗證 結果如圖 1 所示，其中 2為____經酶切電泳的結果。通過對重組質粒測序，驗證連接到質粒的基因與目的基因一致，說明____。

③將 p-5676 轉入BL21菌株，獲得表達菌株BL21（5676），還應將____得到對照菌株 BL21（p），經液體培養抽提質粒酶切驗證，結果如圖 2 所示， 說明纖維素酶表達菌種構建成功。

④分別測定表達菌株BL21（5676）培養液和對照菌株 BL21（p）培養液的____，如果前者顯著大于后者，表明高效表達纖維素酶的工程菌培育 成功，可用于生產實踐。

（3） 綜上研究，表達菌株 BL21（5676）培養液 ____（屬于/不屬于）發酵液。高效降解纖維素的工程菌成功構建，為其在工業中的應用打下良好基礎，未 來后續研究重點你認為可放在哪些方面？ ____。

Answer 1

【答案】枯枝落葉（或纖維素） 稀釋涂布 菌落 菌落和透明圈直徑 Lb1 目的基因 導入 重組表達載體（p-5676） 重組表達載體（p-5676）的構建是成功的 質粒p 葡萄糖含量 屬于 可重點放在發酵工藝的優化，使得纖維素酶在菌株中得到更高量的表達

【解析】

纖維素分解菌可以產生纖維素酶，能將纖維素分解為葡萄糖。篩選并鑒定纖維素分解菌會用到剛果紅染色法，剛果紅能和纖維素形成紅色復合物，當纖維素分解菌產生纖維素酶，周圍的纖維素被分解，則不能形成紅色復合物，此時就會形成以菌落為中心的透明圈。基因工程的流程包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。

（1）生物與環境相適應，為了找到纖維素分解菌，應該在纖維素含量豐富的地方尋找。微生物接種的方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法，稀釋涂布平板法接種的范圍更廣，充分利用的選擇培養基，最終產生的菌落分散得更均勻，能得到更多的單菌落，能在選擇培養基上生長的菌落能分解纖維素。為了從分離得到的眾多菌落中篩選出分解纖維素能力最強的，應該測量菌落和透明圈直徑，如果兩者的差距大，即透明圈直徑/菌落直徑的比值越大的話，說明分解能力越強，Lb1組比值最大，說明Lb1組降解纖維素能力最強。

（2）①要想實現通過基因工程獲得纖維素高表達的工程菌，首先要獲取與纖維素酶高表達相關的目的基因。②之后與運載體（如質粒）構建基因表達載體，構建好之后將重組質粒導入受體細胞大腸桿菌DH5α。用Nde I 和 Kpn I 雙酶切質粒，2中出現長度為1000bp左右的片段，極有可能為目的基因5676基因（長度為1044bp），所以2應該是重組表達載體經酶切電泳的結果，所以能得到5676的目的基因，通過對重組質粒測序，能測到目的基因序列，說明基因表達載體的構建是成功的。③如果導入受體細胞的不是重組質粒，而是質粒p，則經過酶切不能得到5676基因，即長度為1044bp左右的片段。④纖維素被分解產生葡萄糖，如果高效表達纖維素酶的工程菌培育成功，則培養液中葡萄糖的含量應該比較多。

（3）表達菌株 BL21（5676）可用于大量生產葡萄糖，其培養液就是發酵液，后續應用到生產中注意保有纖維素酶的高表達的特性，保證產物的高產。