Question

【題目】基因檢測是指通過檢測生物體中的DNA序列，以了解生物體基因狀況的技術手段。Sanger雙脫氧鏈終止法是DNA測序的基本方法，其原理是:核酸模板在核酸聚合酶、帶有3′-OH末端的單鏈核苷酸引物、四種dNTP存在的條件下復制或轉錄時，如果在反應系統中分別引人單一種類的ddNTP（即2、3雙脫氧核苷三磷酸，在脫氧核糖的3′位置缺少一個羥基，故不能同后續的dNTP形成磷酸二酯鍵），只要ddNTP摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入dNTP的片段可繼續延長。通過電泳將不同長度的片段分開，DNA片段越小，距離起點越遠，根據末端核苷酸可得到原始序列信息。具體流程圖如下。

（1）若待測核酸模板為雙鏈DNA，首先要作____________處理，與引物結合后，在DNA聚合酶作用下子鏈沿____________方向（填“5′端向3′端”或“3′端向5′端”）進行延伸反應。若待測核酸模板為RNA，則需要在____________酶的幫助下合成DNA單鏈片段。

（2）ddNTP為2，3-雙脫氧核苷三磷酸，只要ddNTP摻入鏈端，該鏈就停止延長的原因是____________。

（3）假設某反應體系中，待測DNA單鏈序列3′GTACCGTA5′，加入4種dNTP和ddATP，經過雙脫氧鏈終止法處理，會得到____________種片段，其中最短的片段序列是____________。

（4）假設某次Sanger雙脫氧鏈終止法測序得到的電泳圖如上圖所示，則待測DNA序列從5′端到3′端為____________。

Answer 1

【答案】變性 從5′端向3′端 逆轉錄酶 3號碳上不是羥基，不能與下一個脫氧核苷酸的磷酸形成磷酸二酯鍵 3 CddA ATGGTCATCA

【解析】

讀取信息“在反應系統中分別引人單一種類的ddNTP（即2、3雙脫氧核苷三磷酸，在脫氧核糖的3′位置缺少一個羥基，故不能同后續的dNTP形成磷酸二酯鍵），只要ddNTP摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入dNTP的片段可繼續延長”“DNA片段越小，距離起點越遠，根據末端核苷酸可得到原始序列信息”進行解答。

（1）測定雙鏈DNA的序列需要將DNA進行變性處理，獲得單鏈DNA分子；由于引物是3′-OH末端的單鏈核苷酸，所以子鏈沿著5′端向3′端進行延伸反應；利用RNA獲得DNA單鏈的過程是逆轉錄，所以需要逆轉錄酶。

（2）根據題干信息，ddNTP為2，3-雙脫氧核苷三磷酸其3號碳上不是羥基，不能與下一個脫氧核苷酸的磷酸形成磷酸二酯鍵，所以只要ddNTP摻入鏈端，該鏈就停止延長。

（3）ddATP帶有堿基腺嘌呤，和胸腺嘧啶配對，從5′端向3′端延伸，由于待測序列含有2個胸腺嘧啶，所以可以獲得5′CddA3′，5′CATGGCddA3′，5′CATGGCAT3′共3種片段，最短的序列是CddA。

（4）根據題干信息“DNA片段越小，距離起點越遠，根據末端核苷酸可得到原始序列信息”根據電泳序列，使用ddT獲得了3個片段，其中有最小的和最大片段，因此該DNA序列的第一個和最后一個堿基都是A；按照堿基互補配對的原則，獲得序列ATGGTCATCA。