Question

【題目】下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題：

（1）用圖中質粒和目的基因構建重組質粒，應選用___________________________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過_____________酶作用后獲得重組質粒。為了擴增重組質粒，需將其轉入處于_____________態的大腸桿菌。

（2）為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養基中添加_____________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中_____________________________。

（3）若BamHI酶切的DNA末端與BclI酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為___________________________，對于該部位，這兩種酶_____________（填“都能”、“都不能”或“只有一種能”）切開。

（4）若用Sau3AI切圖1質粒最多可能獲得_______________種大小不同的DNA片段。

Answer 1

【答案】BclⅠ和HindⅢ DNA連接 感受態 四環素 引物甲和引物丙 都不能 7

【解析】

根據表格中限制酶的識別序列的特點可知，BamHI酶、BclI酶和Sau3AI酶切割后的黏性末端相同，故用不同限制酶切割后的黏性末端可能連接在一起。

（1）由圖1可知，BamHI酶在質粒上面有兩個酶切位點，作用后會破壞四環素抗性基因以及氨芐青霉素抗性基因，而且會將質粒水解成兩個片段，再與目的基因連接時容易發生自身環化或產生無標記基因的重組質粒，為保證質粒上仍然保留標記基因，應選用限制酶為BclⅠ和HindⅢ。酶切后的載體和目的基因片段，通過DNA連接酶作用后獲得重組質粒。為了擴增重組質粒，需將其轉入用鈣離子處理的處于感受態的大腸桿菌內。

（2）由于重組質粒上的四環素抗性基因未被破壞，故為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養基中添加四環素，若平板上長出了菌落，說明轉入了重組質粒。由圖中引物延伸的方向，可知PCR復制目的基因時應選用的引物為引物甲和引物丙。

（3）根據圖示中限制酶的酶切后的黏性末端可知，若BamH I酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為。所形成的新的序列不能被上述兩種限制酶識別，故對于該部位，這兩種酶都不能切開。

（4）由表中酶切位點可知，BamHI和BclI識別的序列中都含有Sau3AI的識別序列和切點，圖1中有2個BamHI的酶切位點、1個BclI的酶切位點，所以Sau3AI在質粒上有3個酶切位點。若只有一個Sau3AI切開一個位點，得到一條最長的線性DNA分子，若有兩個Sau3AI同時切開兩個位點，則會形成6種不同長度的DNA片段，若三個酶切位點同時切開，則形成的三個長度的片段與前面重復，故若用Sau3AI切圖1質粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。