Question

【題目】如圖1為某種常用質粒的序列圖，Lac Z基因編碼的酶能使無色的X﹣gal變為藍色，Ampr為氨芐青霉素抗性基因．圖2為目的基因的序列及其相關限制酶的識別序列．請回答下列問題：

（1）若要篩選成功導入目的基因的重組質粒，培養基中應加入的物質有______________，構建重組質粒時需要的工具酶有___________，對獲取的目的基因可用PCR技術對其擴增．

（2）實驗小組用BamH I和Bgl II兩種限制酶切割目的基因和質粒，構建重組質粒后導入大腸桿菌中，在篩選重組質粒的培養基上，若大腸桿菌菌落顯藍色，說明導入了__________．沒有導入任何外源DNA的大腸桿菌_____（填“能”或“不能”）在該培養基上生存．

（3）若質粒和目的基因用BamH I和Bgl II兩種限制酶切割后，用DNA連接酶相連，然后再用BamH I和EcoR I切割成功連接后的重組質粒，可獲得長度不同的_____種DNA片段．

Answer 1

【答案】X-gal、氨芐青霉素 限制酶、DNA連接酶 未導入目的基因的空質粒 不能 4

【解析】

分析題圖：質粒中，抗氨芐青霉素抗性基因（Amp'）和LacZ基因都屬于標記基因，含有目的基因的外源DNA分子上存在BamHⅠ和BlgⅡ兩種酶的酶切位點，質粒上存在BamHⅠ和EcoRⅠ兩種酶的酶切位點。一般為了防止目的基因和質粒反向連接，用兩種限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和質粒。

（1）由于LacZ基因編碼的酶能使無色的X-gal變為藍色，Amp為氨芐青霉素抗性基因，所以若要篩選成功導入目的基因的重組質粒，培養基中應加入的物質有X-gal和氨芐青霉素。構建基因表達載體時，首先要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA和運載體，其次用DNA連接酶將目的基因與運載體連接形成重組DNA。

（2）構建重組質粒后導入大腸桿菌中，在篩選重組質粒的培養基上，由于LacZ基因編碼的酶能使無色的X-gal變為藍色，若大腸桿菌菌落顯藍色，說明導入的是不含目的基因的空白質粒。若大腸桿菌菌落顯白色，說明LacZ基因被破壞，不能編碼相應的酶，所以導入的是重組質粒。沒有導入任何外源DNA的大腸桿菌不含氨芐青霉素抗性基因，所以不能在該培養基上生存。

（3）BamHI和BglII兩種限制酶切割形成的黏性末端相同，可在DNA連接酶的作用下連接起來。若質粒和目的基因用BamHI和BglII兩種限制酶切割后，用DNA連接酶相連，可能會發生正向連接，也可能會發生反向連接。用BamHI和EcoRI切割成功連接后的重組質粒，若正向連接，切割后會得到兩種長度不同的DNA片段，若反向連接，切割后會得到另外兩種長度不同的DNA片段，因此，用BamHI和EcoRI切割成功連接后的重組質粒，可獲得長度不同的4種DNA片段。