Question

【題目】科研人員用基因工程技術(shù)構(gòu)建擬南芥突變體庫，并研究光信號(hào)（遠(yuǎn)紅光）控制擬南芥種子萌發(fā)時(shí)下胚軸生長的分子機(jī)制。

（1）擬南芥突變體庫的構(gòu)建過程如下。

①將插入了氨芐青霉素抗性基因的T-DNA與農(nóng)桿菌在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化液。將轉(zhuǎn)化液稀釋后對(duì)野生型擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，繼續(xù)培養(yǎng)擬南芥植株并收獲其種子，再將種子放入含有____________的培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選出能正常萌發(fā)的種子，命名為F1代種子, F1代種子因插入了含有氨芐青霉素抗性基因的T-DNA導(dǎo)致DNA分子發(fā)生了_____________這一分子結(jié)構(gòu)上的變化。

②下面是利用F1種子構(gòu)建純合突變體庫的流程圖。

將每株F1植株所結(jié)種子（F2代種子）單株存放，用①中的方法篩選F2代種子，表現(xiàn)為正常萌發(fā)和不能正常萌發(fā)比例約為____________時(shí)，F(xiàn)1植株為單拷貝插入（只有一個(gè)位點(diǎn)插入T-DNA）的雜合轉(zhuǎn)基因植株用同樣的方法篩選出單株F2。植株所結(jié)種子（F3代種子），若都能正常萌發(fā)，則F3植株為純合轉(zhuǎn)基因植株；F3自交得到F4代種子即為純合突變體庫。

（2）將上述突變體庫中的種子置于遠(yuǎn)紅光條件下培養(yǎng)，挑選出擬南芥種子萌發(fā)時(shí)下胚軸明顯變長的甲、乙、丙三個(gè)突變體植株。

①將甲、乙、丙分別與野生型雜交，其后代種子在遠(yuǎn)紅光下培養(yǎng)，萌發(fā)時(shí)均表現(xiàn)為下胚軸長度與野生型無明顯差異，說明3株突變均為___________突變。

②將甲和乙雜交得到種子在遠(yuǎn)紅光下培養(yǎng)，萌發(fā)時(shí)下胚軸長度與甲和乙兩株相比均無明顯差異。請(qǐng)?jiān)趫D畫出甲、乙突變基因與其以及對(duì)應(yīng)的染色體的關(guān)系______（甲的基因用A或a、乙的基因用B或b表示）。

③將甲和丙雜交得到種子在遠(yuǎn)紅光下培養(yǎng)，萌發(fā)時(shí)表現(xiàn)為________則可推測(cè)甲和丙的突變基因?yàn)榉堑任换�因�?/span>

（3）科研人員還獲得了甲和丙的雙突變體，并在遠(yuǎn)紅光條件下培養(yǎng)，測(cè)定其種子萌發(fā)時(shí)下胚軸的長度，結(jié)果如下圖。

有人提出了下面兩種種子萌發(fā)時(shí)基因調(diào)控下胚軸生長的示意圖（A、a表示甲的相關(guān)基因；D、d表示丙的相關(guān)基因）。

為驗(yàn)證上述兩種推測(cè)是否正確，進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)。

①已知A基因控制A蛋白的合成，D基因控制D蛋白的合成。研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)紅光下，D蛋白進(jìn)核后才能調(diào)控種子萌發(fā)時(shí)下胚軸的生長。將綠色熒光蛋白基因與D基因啟動(dòng)子連接，分別轉(zhuǎn)入野生型和突變體甲，將其幼苗在黑暗處理4天，再在遠(yuǎn)紅光處理30分鐘，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞核中均出現(xiàn)綠色熒光且強(qiáng)度無明顯差異。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明_____________________________

②分別提取黑暗條件和遠(yuǎn)紅光條件下野生型和突變型甲的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白，得到D蛋白的電泳結(jié)果如下圖。

上述結(jié)果表明，在遠(yuǎn)紅光條件下，磷酸化D蛋白只在___________擬南芥植株的__________中大量積累，由此推測(cè)______________（圖1、圖2）更為合理。

Answer 1

【答案】氨芐青霉素 堿基對(duì)的增加 3：1 隱性 下胚軸長度與野生型無明顯差別 A蛋白不參與遠(yuǎn)紅光條件下D蛋白向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移 野生型 細(xì)胞核 圖1

【解析】

1、Ti質(zhì)粒上有一段特殊的DNA區(qū)段，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，該DNA區(qū)段能自發(fā)轉(zhuǎn)移，插入植物染色體DNA中，Ti質(zhì)粒上的這一段能轉(zhuǎn)移的DNA被稱為T-DNA。根據(jù)這一現(xiàn)象，將Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造，將相關(guān)基因置入T-DNA區(qū)段中，可通過農(nóng)桿菌侵染細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)χ参锏倪z傳轉(zhuǎn)化。利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，是獲得植物突變體的一種重要方法；

2、含有氨芐青霉素抗性基因的擬南芥植株產(chǎn)生的種子，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中能正常萌發(fā)。光信號(hào)（遠(yuǎn)紅光）對(duì)擬南芥種子萌發(fā)時(shí)下胚軸的長度有影響。

（1）①將氨芐青霉素抗性基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，構(gòu)建基因表達(dá)載體，即重組質(zhì)粒，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。將轉(zhuǎn)化液稀釋后對(duì)野生型擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，繼續(xù)培養(yǎng)擬南芥植株并收獲其種子，再將種子放入含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選出能正常萌發(fā)的種子，命名為F1代種子, F1代種子因插入了含有氨芐青霉素抗性基因的T-DNA導(dǎo)致基因突變，即DNA分子發(fā)生了堿基對(duì)的增加這一分子結(jié)構(gòu)上的變化。

②F1植株為單拷貝插入（只有一個(gè)位點(diǎn)插入T-DNA）的雜合轉(zhuǎn)基因植株用同樣的方法篩選出單株F2。植株所結(jié)種子（F3代種子），若都能正常萌發(fā)，則F3植株為純合轉(zhuǎn)基因植株；F3自交得到F4代種子即為純合突變體庫。由于F1植株為雜合子,即突變型擬南芥（假設(shè)基因型為Aa）自交后代中，氨芐青霉素抗性（A_）：氨芐青霉素敏感（aa）=3:1，將每株F1植株所結(jié)種子（F2代種子）單株存放，用①中的方法篩選F2代種子，含有氨芐青霉素抗性基因的種子能夠正常萌發(fā)，因此，表現(xiàn)為正常萌發(fā)和不能正常萌發(fā)比例約為3:1。

（2）①基因突變分為顯性突變和隱性突變。將甲、乙、丙分別與野生型雜交，其后代種子在遠(yuǎn)紅光下培養(yǎng)，萌發(fā)時(shí)均表現(xiàn)為下胚軸長度與野生型無明顯差異，說明野生型為顯性性狀， 3種突變均為隱性突變。

②甲和乙發(fā)生的均為隱性突變，將甲和乙雜交得到種子在遠(yuǎn)紅光下培養(yǎng)，萌發(fā)時(shí)下胚軸長度與甲和乙兩株相比均無明顯差異，說明長度與甲、乙比，沒有區(qū)別，因此，是同一位點(diǎn)的基因突變。甲的基因用A或a、乙的基因用B或b表示，則甲突變個(gè)體是A突變?yōu)閍，乙突變個(gè)體是B突變?yōu)閎，甲、乙突變基因與其以及對(duì)應(yīng)的染色體的關(guān)系如圖所示：

③將甲和丙雜交得到種子在遠(yuǎn)紅光下培養(yǎng)，萌發(fā)時(shí)表現(xiàn)為下胚軸長度與野生型無明顯差異，說明甲丙突變的不是同一位點(diǎn)，則可推測(cè)甲和丙的突變基因?yàn)榉堑任换�因�?/span>

（3）①經(jīng)過前面的分析，突變體均為隱性突變，故野生型基因型為AADD，甲突變體的基因型為aaDD，丙突變體的基因型為AAdd，雙突變體的基因型為aadd。已知A基因控制A蛋白的合成，D基因控制D蛋白的合成。研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)紅光下，D蛋白進(jìn)核后才能調(diào)控種子萌發(fā)時(shí)下胚軸的生長。將綠色熒光蛋白基因與D基因啟動(dòng)子連接，分別轉(zhuǎn)入野生型和突變體甲，將其幼苗在黑暗處理4天，再在遠(yuǎn)紅光處理30分鐘，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞核中均出現(xiàn)綠色熒光且強(qiáng)度無明顯差異。野生型有A基因，即有A蛋白，甲無A基因，即無A蛋白，故自變量為A蛋白的有無，而兩者細(xì)胞核中均有綠色熒光，即兩者均有D蛋白向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，因此，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明A蛋白不參與遠(yuǎn)紅光條件下D蛋白向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。

②D蛋白的電泳結(jié)果圖表明，1代表磷酸化D蛋白，即為功能異常的D蛋白，2代表非磷酸化D蛋白，即為功能正常的D蛋白，在遠(yuǎn)紅光條件下，野生型的細(xì)胞核中既有磷酸化D蛋白，又有非磷酸化D蛋白，而甲突變體aaDD的細(xì)胞核中只有正常功能的D蛋白，說明甲突變體aaDD抑制了D基因的磷酸化，因此，磷酸化D蛋白只在野生型擬南芥植株的細(xì)胞核中大量積累，由此推測(cè)圖1更為合理。