Question

【題目】蜘蛛絲是自然界中機械性能最好的天然蛋白纖維，其強度高于制作防彈衣的凱夫拉纖維，有廣泛的應用前景。但如何大量獲取蜘蛛絲纖維的問題一直難以解決。2018年8月，中科院分子植物科學卓越創新中心利用基因工程技術成功的在家蠶絲腺和蠶繭中大量表達蜘蛛絲蛋白。回答下列問題：

（1）構建基因表達載體時（如圖所示），需要在目的基因前后兩端分別引入______________的酶切位點，該方法比用同一種酶進行酶切的優勢是___________________________（答出一點即可）。

（2）利用PCR技術擴增蜘蛛絲基因前，需根據目的基因的核苷酸序列設計____種引物，進行PCR時需加熱至90～95℃然后冷卻至55～60℃，此操作的目的是__________________。

（3）為能從蠶絲中提取蛛絲蛋白，基因表達載體中目的基因的首段必須含有使其僅能在蠶的絲腺細胞中特異性表達的_______。當其與______識別和結合，才能驅動轉錄過程，最終翻譯成功。

（4）在研究過程中，發現目的基因已經插入到蠶絲腺細胞染色體的DNA上，蠶絲中卻未能提取到蜘蛛絲，請分析原因及檢測方法_________________。

（5）研究人員發現若將蛛絲蛋白31號位的色氨酸替換為酪氨酸，蛛絲韌性可提高50%，此成果所用到的工程技術為_____________________________________________。

Answer 1

【答案】Xba I和Sac I 防止目的基因自身環化、防止目的基因反向連接 2 使DNA解鏈，然后使引物結合到互補DNA鏈上 啟動子 RNA聚合酶 蛛絲蛋白基因未能正常進行轉錄可用分子雜交技術檢測，蛛絲蛋白未能進行正常翻譯可用抗原抗體雜交技術檢測 蛋白質工程

【解析】

在構建基因表達載體時，可用一種或者多種限制酶進行切割，為了避免目的基因和載體在酶切后產生的末端發生任意連接，一般選用兩種限制酶分別對目的基因、運載體進行切割。一個基因表達載體的組成，主要有目的基因、標記基因、啟動子和終止子，其中啟動子位于基因首端，是RNA聚合酶識別和結合的位點，標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。據此根據題圖，HindⅢ在標記基因中，故不能使用，只能選擇Xba I和Sac I兩種酶進行切割。PCR技術擴增DNA時，需要的條件有：目的基因、一對引物、四種脫氧核苷酸、熱穩定DNA聚合酶等，反應過程是變性（當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈）→復性（溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合）→延伸（72℃左右時，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新鏈由5'端向3'端延伸）。檢測目的基因是否轉錄出了mRNA可用分子雜交技術；檢測目的基因是否翻譯成蛋白質可用抗原-抗體雜交技術。

（1）據分析可知，構建基因表達載體時需要在目的基因前后兩端分別引入Xba I和Sac I 的酶切位點，相比用同一種酶進行酶切，用兩種酶切割可以防止目的基因自身環化或防止目的基因反向連接。

（2）利用PCR技術擴增蜘蛛絲基因前，需根據目的基因的核苷酸序列設計2種引物；進行PCR時需加熱至90～95℃然后冷卻至55～60℃，此操作的目的是使DNA解鏈，然后使引物結合到互補DNA鏈上。

（3）為能從蠶絲中提取蛛絲蛋白，基因表達載體中目的基因的首段必須含有使其僅能在蠶的絲腺細胞中特異性表達的啟動子。當其與RNA聚合酶識別和結合，才能驅動轉錄過程，最終翻譯成功。

（4）在研究過程中，發現目的基因已經插入到蠶絲腺細胞染色體的DNA上，蠶絲中卻未能提取到蜘蛛絲，推測有兩種可能，①是目的基因導入但沒有正常轉錄，若蛛絲蛋白基因未能正常進行轉錄可用分子雜交技術檢測；②是目的基因轉錄后沒有翻譯產生蛋白質，若蛛絲蛋白未能進行正常翻譯可用抗原-抗體雜交技術檢測。

（5）研究人員發現若將蛛絲蛋白31號位的色氨酸替換為酪氨酸，蛛絲韌性可提高50%，此成果所用到的工程技術為蛋白質工程。