Question

【題目】癌細胞表面蛋白“PDL-1”與T細胞表面蛋白“PD-1”特異性結合后，可抑制T細胞活性并啟動其凋亡，導致腫瘤細胞發生免疫“逃逸”。研究者對“PD-1”基因進行克隆、表達及生物學活性鑒定，為制備抗體打基礎。研究中所用引物α和β堿基序列見圖1、幾種常用限制酶名稱及識別序列與酶切位點見圖2：

α鏈：5'-T C A C T C G A G A C C A T G C A G A T C C C A C A G G C G C C C-3' β鏈：5'-C T C G A A T T C T C A G A G G G G C C A A G A G C A G T G-3' 圖1

（1）首先提取細胞中的mRNA反轉錄生成____________________作為模板；設計含有不同的限制酶切點的α和β序列為引物，通過____________________技術擴增目的基因。

（2）選用圖1中的兩種名稱分別為____________________的限制酶將“pIRES2-EGFP質粒”載體進行雙切，再用DNA連接酶將其與目的基因拼接，構建表達載體。該表達載體的組成，除了目的基因、標記基因抗卡那霉素基因外，還必須具有____________________等。

（3）而后一定溫度下，與經過處理的感受態大腸桿菌混合培養在含有_____________培養基中，可篩選出已經完成轉化的大腸桿菌，繼續培養該種大腸桿菌以擴增重組DNA。

（4）將擴增后的“pIRES2-EGFP載體/PD-1重組DNA”轉入可高度表達外源基因的原代293T細胞。一段時間后，為確定PD-1基因是否表達，檢測細胞膜表面是否具有____________________。為判斷其是否具有生物學活性和功能，則可裂解293T細胞，提取該物質看能否與____________________發生結合，從而阻斷“PD-1與PDL-1信號通路”。研究中還會有一步驟，只將“pIRES2-EGFP載體”轉入293T細胞，其目的是_________________________。

Answer 1

【答案】cDNA PCR Xho I EoR I 啟動子、終止子、復制原點 卡那霉素 PD-1蛋白 PDL-1或答PD-1抗體 作為對照

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因采用DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA采用分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質采用抗原—抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）基因文庫包括基因組文庫和部分基因文庫（cDNA）。其中基因組文庫包含某種生物所有的基因，而部分基因文庫只包含某種生物的部分基因，可以mRNA為模板反轉錄形成cDNA；由于PCR技術利用的是DNA分子復制的原理，所以用該cDNA進行PCR技術擴增短時間內可以獲得大量的目的基因。

（2）分析圖1中堿基序列，α鏈上有“—CTCGAC—”識別序列，β鏈上有“—GAATTC—”堿基識別序列，與圖2中XhoI限制酶和EoRI限制酶的識別序列相同。故選用XhoI限制酶和EoRI限制酶將“pIRES2-EGFP質�！陛d體進行雙切，再用DNA連接酶將其與目的基因拼接，構建基因表達載體�；�因表達載體的組成包括目的基因、標記基因、啟動子、終止子、復制原點等。

（3）根據第（2）題可知，基因表達載體上的標記基因是卡那霉素抗性基因，因此一定溫度下，與經過 Ca2+處理的感受態大腸桿菌混合培養在含有卡那霉素的培養基，可篩選出已經完成轉化的大腸桿菌。

（4）基因表達的產物是蛋白質，一段時間后，為確定PD-1基因是否表達，可以檢測細胞膜表面是否具有PD-1基因表達的PD-1蛋白。為判斷其是否具有生物學活性和功能，可采用抗原—抗體雜交技術，即從裂解293T細胞中，提取PD-1蛋白看能否與PDL-1發生結合，從而阻斷“PD-1與PDL-1信號通路”。為了增加實驗的可信度，還需要設置對照實驗，只將“pIRES2-EGFP載體”轉入293T細胞，因為不含PD-1基因，所以“PD-1與PDL-1信號通路”不會阻斷。