Question

【題目】回答下列有關現代生物技術的問題。

哺乳動物細胞產生的酶M在工業上極具應用價值，現擬利用大腸桿菌大規模生產該酶。哺乳動物DNA片段如圖1所示，用作運載體的質粒pXY6如圖2所示，VanR表示萬古霉素抗性基因，GFP基因則編碼綠色熒光蛋白，大腸桿菌不具有這兩種基因。相關限制酶的所有酶切位點均已于圖上標注，識別序列見表。

NsiI	PstI	SbfI	BclI	BspEI
ATGCA↓T T↑ACGTA	CTGCA↓G G↑ACGTC	CCTGCA↓GG GG↑ACGTCC	T↓GATCA ACTAG↑T	T↓CCGGA AGGCC↑T

（重組質粒的構建及分析）

（1）現要在只使用一種限制酶的情況下，從哺乳動物DNA中切下酶M基因，并切開質粒pXY6，連接二者獲得重組質粒pXY7，則應選擇的限制酶是___________。

（2）若用BspE1和SbfI聯合酶切質粒pXY6，可得1.2kb和2.1kb兩種長度的片段。若用BspE1單獨酶切若干份質粒pXY7，則有兩種不同的酶切結果：其中一種結果得1.7kb和3.1kb兩種長度的片段，則另一種結果得___________kb和___________kb兩種長度的片段。

（工程菌的篩選及產品加工）

（3）被成功導入pXY7質粒的工程菌應具備的特點是___________

A．具萬古霉素抗性，發綠色熒光 B．具萬古霉素抗性，不發綠色熒光

C．不具萬古霉素抗性，發綠色熒光 D．不具萬古霉素抗性，不發綠色熒光

（4）對工程菌生產出的酶M進行分離純化的步驟是（用數字編號填空）：

破碎細胞→過濾獲濾液→___________→___________→___________→酶制劑

①通過層析提純酶蛋白 ②通過冷凍干燥結晶酶蛋白 ③改變pH或加入硫酸銨使酶蛋白沉淀

（5）上述工藝流程涉及的生物工程領域包括___________（多選）

A．發酵工程 B．基因工程 C．細胞工程 D．酶工程

Answer 1

【答案】PstI 2.7 2.1 B ③ ① ② BD

【解析】

基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的獲取：（1）目的基因是指： 編碼蛋白質的結構基因。（2）獲取方法：①從基因文庫中獲取；②人工合成（反轉錄法和化學合成法）；③PCR技術擴增目的基因。

2、基因表達載體的構建:（1）目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發揮作用。（2）組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因。①啟動子：是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質。②終止子：也是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的尾端。③標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是抗生素基因。

3、將目的基因導入受體細胞:（1）轉化的概念：是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。（2）常用的轉化方法：常用方法有農桿菌轉化法、顯微注射技術、Ca2+處理法。（3）重組細胞導入受體細胞后，篩選含有基因表達載體受體細胞的依據是標記基因是否表達。

4、目的基因的檢測和表達：（1）首先要檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術。（2）其次還要檢測目的基因是否轉錄出mRNA，方法是用標記的目的基因作探針與mRNA雜交。（3）最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的抗體進行抗原--抗體雜交。（4）有時還需進行個體生物學水平的鑒定。如轉基因抗蟲植物是否出現抗蟲性狀。

（1）現要在只使用一種限制酶的情況下，從哺乳動物DNA中切下酶M基因，并切開質粒pXY6，連接二者獲得重組質粒pXY7，所選的限制酶應該在目的基因和質粒上都有識別及切割位點，結合圖1、圖2及表格信息判斷，可以選擇限制酶PstI。

（2）若用BspE1和SbfI聯合酶切質粒pXY6，可得1.2kb和2.1kb兩種長度的片段。說明上邊BspE1和SbfI之間為1.2kb，下邊為2.1kb，若用BspE1單獨酶切若干份質粒pXY7，另一種結果得1.2+1.5＝2.7kb和2.1kb。

（3）被成功導入pXY7質粒的工程菌萬古霉素抗性基因，不含GFP基因，所以工程菌具萬古霉素抗性，不發綠色熒光的特點，故選B。

（4）通過加入硫酸銨的方式讓蛋白質沉淀，通過層析的方式對蛋白進行提純，通過冷凍干燥結晶酶蛋白，故順序是③①②。

（5）上述工藝流程涉及的生物工程領域包括基因工程和酶工程，故選BD。