Question

【題目】骨缺損治療是臨床工作的一大挑戰。骨髓間充質干細胞常用于骨和軟骨的再生，但不適合長期培養。科學家基于CRISPR/Cas9同源定向修復（HDR）機制，將永生化癌基因SV40T靶向整合到小鼠Rosa26基因座，建立了永生化的BMSC，使用腺病毒載體轉染BMP-9后可以有效地誘導異位成骨。HDR機制的原理是：用單個具有引導作用的sgRNA引導Cas9核酸酶對DNA進行定點切割（圖1），DNA雙鏈發生斷裂后，在同源模板DNA存在時，通過HDR途徑，根據模板供體DNA序列在預定位點精確整合DNA序列（圖2）。回答下列問題：

（1）sgRNA之所以能引導Cas9核酸酶對DNA進行定點切割，是因為其序列能與小鼠DNA特定位點（靶位點）進行____________。據此分析，需確定靶位點序列在基因組中唯一性的原因是___________________________。

（2）運用CRISPR/Cas9系統時，可將sgRNA和Cas9mRNA元件導入小鼠的受精卵，使用的方法是____________。還可通過腺病毒將CRISPR系統運送到細胞內，腺病毒能夠感染分裂和非分裂細胞，且不會將其DNA整合到宿主細胞基因組中，為基因治療設計的腺病毒應具備的特點是_______________________（至少答出兩點）。

（3）可提取小鼠的基因組DNA作為模板，利用PCR技術檢測SV40T基因是否成功整合到小鼠Rosa26基因座中。利用PCR技術擴增目的基因時應使用____________種引物，需要合成引物的原因是__________________。

Answer 1

【答案】堿基互補配對 防止基因組中存在一段以上能與sgRNA進行堿基互補配對的序列，從而避免其他基因被破壞 顯微注射法 具有標記基因；有一個或多個限制酶的識別和切割位點 兩 Taq 酶只能聚合單個脫氧核苷酸到已有的核苷酸鏈上，不能從頭合成DNA

【解析】

基因工程的基本內容包括：（1）外源目標基因的分離、克隆以及目標基因的結構與功能研究；（2）適合轉移、表達載體的構建或目標基因的表達調控結構重組；（3）外源基因的導入；（4）外源基因在宿主基因組上的整合、表達及檢測與轉基因生物的篩選。

根據題意分析可知，sgRNA能引導Cas9核酸酶對DNA進行定點切割，圖1,2所示為基因工程中構建目的基因的步驟。

（1）sgRNA之所以能引導Cas9核酸酶對DNA進行定點切割，是因為其序列能與小鼠DNA特定位點（靶位點）進行堿基互補配對。需確定靶位點序列在基因組中唯一性的原因是防止基因組中存在一段以上能與sgRNA進行堿基互補配對的序列，從而破壞其他基因。

（2）將sgRNA和Cas9mRNA元件導入小鼠的受精卵，使用的方法是顯微注射法。通過腺病毒將CRISPR系統運送到細胞內，為基因治療設計的腺病毒應具備的特點是具有自我復制能力、具有標記基因、有一個或多個限制酶的識別和切割位點。

（3）利用PCR技術擴增目的基因時應使用兩種引物，需要合成引物的原因是Taq酶不能從頭合成DNA，只能聚合單個脫氧核苷酸到已有的核苷酸鏈上。