Question

【題目】蚯蚓富含金屬硫蛋白（MT），能吸收土壤中的鎘�，F通過基因工程技術把MT基因導入煙草植株并高效表達，以清除土壤中的鎘。下圖是科學家培育轉MT基因煙草的流程圖。請回答下列問題：

（1）過程①是用提取的mRNA為材料來獲得cDNA，其原理是______________________。需要獲得MT基因的核苷酸序列，以便根據序列合成_____________用于PCR擴增。

（2）過程②分別用兩種限制酶剪切MT基因和質粒，使_________________，保證了MT基因與質粒定向連接。構建重組質粒時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是____________。

（3）過程③可以利用__________處理農桿菌，以利于重組質粒進入。在培育轉MT基因煙草的過程中，農桿菌的作用是_____________________________________。

（4）為檢測煙草植株中是否轉錄出了mRNA，可用_________________________與提取出的煙草mRNA雜交，看是否出現雜交帶。

Answer 1

【答案】在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對原則來合成cDNA 引物 MT基因、質粒片段的兩端產生不同的黏性末端 磷酸二酯鍵 Ca2+ 農桿菌能感染煙草，將MT基因轉移到煙草受體細胞中 標記的MT基因作探針

【解析】

識圖分析可知，圖示表示科學家培育轉MT基因煙草的流程圖，圖中①過程是以mRNA為模板合成cDNA的過程，即逆轉錄法，該過程需要逆轉錄酶的催化作用；圖中②過程為構建重組質粒的過程，需要限制酶切割磷酸二酯鍵產生末端，同時需要DNA連接酶將切開的DNA分子片段之間的磷酸二酯鍵恢復，從而形成重組質粒；過程③是將重組質粒導入農桿菌的過程，一般采用感受態細胞法處理，用一定濃度的Ca2+溶液處理農桿菌，使其處于感受態，便于吸收周圍環境中的DNA分子。然后再用農桿菌侵染煙草的細胞，在農桿菌T-DNA的作用下將目的基因轉移到受體細胞染色體的DNA上，完成轉化過程。檢測目的基因是否導入受體細胞可以采用DNA分子雜交法，檢測目的基因是否轉錄可以采用分子雜交法，檢測目的基因是否翻譯，采用抗原-抗體雜交法。

（1）根據以上分析可知，過程①是通過逆轉錄法獲取目的基因的過程，原理是在逆轉錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對原則來合成cDNA。在PCR擴增的過程中，需要獲得MT基因的核苷酸序列，以便根據序列合成引物。

（2）過程②分別用兩種限制酶剪切MT基因和質粒，選擇兩種限制酶切割可以使MT基因、質粒片段的兩端產生不同的黏性末端，防止自身的環化和目的基因與質粒之間的反向連接，保證了MT基因與質粒定向連接。構建重組質粒時，DNA連接酶催化形成的化學鍵是磷酸二酯鍵。

（3）過程③是將重組質粒導入農桿菌的過程，一般采用感受態細胞法，用一定濃度的Ca2+溶液處理農桿菌，使其處于感受態，以利于重組質粒進入。在培育轉MT基因煙草的過程中，利用了農桿菌轉化法，即在農桿菌T-DNA的作用下將目的基因轉移到受體細胞染色體的DNA上，完成轉化過程。

（4）為檢測煙草植株中是否轉錄出了mRNA，可用分子雜交法，即以標記的MT基因作探針，與煙草細胞中提取出的總mRNA進行雜交，如果產生雜交帶即說明完成了轉錄過程。