Question

【題目】蛋白酶廣泛用于化工、食品、醫藥工業，因此采用生物工程技術規模化生產重組蛋白酶具有重要經濟價值。已知某蛋白酶編碼基因的兩端分別為KpnI和ClaI限制酶酶切位點，現將之插入在質粒pCLY9合適位點處（圖1），并導入大腸桿菌L44株中高效表達。L44株因缺乏gatB基因不能以NH4Cl為原料合成重要的細胞大分子，而且對氯霉素（Cm）敏感。

（1）若用ClaI和KpnI 酶切pCLY9可獲得0.8和4.8kb兩種片段；而用KpnI和SmaI酶切重組質粒可獲得2.5和3.1kb兩種片段，那么目的基因的大小是_____kb。

（2）為了獲得含重組質粒的細胞，應采用兩步法篩選。其中用于第一步篩選的固體培養基的配方是_____。

A．蛋白胨、酵母粉、牛肉膏

B．葡萄糖、NH4Cl、生長因子

C．牛肉膏、酵母粉、NH4Cl、氯霉素

D．葡萄糖、蛋白胨、生長因子、氯霉素

（3）上述含重組質粒的大腸桿菌經大規模培養后，破碎菌體獲得細胞裂解液。圖2是裂解液中多種酶活性隨溫度變化的趨勢，由此可以判斷該重組蛋白酶在實際應用中的最佳反應溫度范圍應從_____℃到_____℃。

（4）一般而言，固定化處理能不同程度地提高酶的熱穩定性。若將上述大腸桿菌細胞裂解液不經分離純化直接固定化，能否充分體現這種蛋白酶的使用優勢？_____，為什么？_____。

（5）本大題中所涉及的生物工程包括_____。

A．基因工程 B．細胞工程 C．發酵工程 D．酶工程

Answer 1

【答案】0.8 A 55 70 不能 雜酶也會因固定化而變得熱穩定，這樣不便與高溫蛋白酶的活性相隔離 ACD

【解析】

1、獲得目的基因的方法：①從基因文庫中獲取 ②利用PCR技術擴增 ③人工合成（化學合成）．原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成。

2、“分子手術刀”--限制性核酸內切酶（限制酶）

（1）來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。

（2）功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。

3、基因表達載體的構建目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在并且可以遺傳給下一代并表達和發揮作用。基因表達載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因，標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。

（1）由題意知：用ClaI和KpnI 酶切pCLY9可獲得0.8和4.8kb兩種片段，而用KpnI和SmaI酶切重組質粒可獲得2.5和3.1kb兩種片段，說明質粒的長度為5.6kb，目的基因的大小是0.8kb。

（2）采用兩步法篩選獲得含重組質粒的細胞，第一步篩選的固體培養基含有蛋白胨、酵母粉、牛肉膏，故選A。

（3）由圖2可知：在30℃到55℃，雖然重組蛋白酶活性高，但其余雜酶的活性也高，故該重組蛋白酶在實際應用中的最佳反應溫度范圍應從55℃到70℃。

（4）由于雜酶也會因固定化而變得熱穩定，這樣不便與高溫蛋白酶的活性相隔離，故若大腸桿菌細胞裂解液不經分離純化直接固定化，不能充分體現該蛋白酶的使用優勢。

（5）本題涉及基因工程、發酵工程及酶工程的相關知識，故選ACD。