Question

【題目】我國一科研團隊將小麥液泡膜Na+/K+逆向轉運蛋白基因（TaNHX2基因）轉移到水稻細胞內，獲得了轉基因耐鹽水稻新品種。回答下列有關問題：

（1）獲取目的基因的方法很多。若TaNHX2基因序列未知，怎樣從已構建好的基因文庫（大腸桿菌作為受體細菌）中獲取含TaNHX2基因的菌株？______________________________。若已知TaNHX2基因序列，可以用PCR擴增該基因。首先根據序列設計、合成__________并投入PCR反應體系，同時，還需要放入dNTP、目的基因、Taq酶等。還可以人工合成TaNHX2基因，如圖1表示人工合成了兩條若干個堿基的DNA單鏈，兩條鏈通過18個堿基對形成部分雙鏈DNA片段，再利用Klenow酶補平，獲得雙鏈DNA。從功能看，Klenow酶是一種__________酶。

（2）圖2是3種限制酶的識別與酶切位點示意圖，構建基因表達載體的時候，經BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以與圖3所示質粒被__________酶切后的產物連接，理由是____________________。連接后的重組質粒__________（填“能”、“不能”或“不一定能”）被BamHⅠ切割。

（3）基因表達載體通過農桿菌轉化作用，就可以使目的基因進入植物細胞，并將其__________，使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達。

Answer 1

【答案】使用高鹽濃度的培養基進行篩選，能生存的菌株即含TaNHX2基因的菌株引物DNA聚合BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種酶切割片段產生的黏性末端互補不一定插入到植物細胞的染色體DNA上

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術；個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）根據題干信息分析可知， TaNHX2基因為Na+/K+逆向轉運蛋白基因，說明TaNHX2基因能控制生物的耐鹽性狀，因此應該使用高鹽濃度的培養基進行篩選，能生存的菌株即含TaNHX2基因的菌株。PCR技術擴增目的基因的前提條件是有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物。根據題意和圖示分析，Klenow酶可以將DNA的單鏈區補平，獲得雙鏈DNA，說明Klenow酶是一種DNA聚合酶。

（2）根據圖2分析，BamHⅠ酶和Sau3AⅠ酶切割后漏出來的粘性末端相同，可以互補配對，因此構建基因表達載體的時候，經BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以與圖3所示質粒被BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種酶切后的產物連接。若質粒被Sau3AⅠ酶切割后與目的基因相連，則產生的堿基序列不同于BamHⅠ酶的識別序列，因此連接后的重組質粒不一定能被BamHⅠ切割。

（3）采用農桿菌轉化法將目的基因導入植物細胞時，先要將目的基因插入農桿菌Ti質粒的T-DNA中，然后用該農桿菌感染植物細胞，通過DNA重組將目的基因插入植物細胞的染色體DNA上，使目的基因的遺傳特性得以穩定維持和表達。