Question

【題目】抗生素濫用導致的耐藥性目前已成為一個嚴重的公共健康問題，近年來，“超級細菌”等事件的發生更顯示出這一問題的嚴重性。抗菌肽（AMPs）是一類具有廣譜抗菌性，而且其不易產生耐藥性。為了改善抗菌肽的抗菌功能，常利用基因工程技術使抗菌肽在不同來源的宿主細胞內進行蛋白的重組表達。β-防御素是一種抗菌肽。構建β-防御素（β-defensin130）表達載體在大腸桿菌中表達。表達載體（PET-28a）和含有目的基因β-防御素（defensin130）的片段如下，結合已知條件回答下列問題：

（說明：Kanr和Ampr分別表示卡那霉素和氨芐青霉素抗性基因；promoter表示基因的啟動部位）

（1）獲得含有目的基因的重組DNA分子，需用___________和___________兩種酶分別切割表達載體和含有目的基因的片段，并用___________酶將它們連接。

（2）把構建好的重組DNA分子導入到受體細胞，用適宜濃度的氯化鈣處理受體細胞增加細胞壁的通透性的目的是___________。

（3）篩選含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受體細胞，先將菌液涂布在含有___________（抗生素）的培養基中培養，然后將所有菌落轉移至含有___________（抗生素）的培養基中培養，最后挑選出目的菌落。

（4）在無菌操作下將目的單菌落用接種環取出，再用劃線法接種在斜面上，37°C培養24小時后，置于___________冰箱中保存。

（5）若受體細胞為雙子葉植物，常用___________法將目的基因導入植物體細胞，再將體細胞進行組織培養，得到轉基因植物。

Answer 1

【答案】EcoRI XhoI DNA連接酶 增加轉化的成功率 Kan Amp 4°C 農桿菌轉化

【解析】

基因工程的步驟包括：提取目的基因、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測和鑒定。菌種保藏包括臨時保藏和長期保存。臨時保藏是將菌種接種在固體斜面培養基上，在合適的溫度下培養，當菌落長成后，將試管置于4°C冰箱中保存。

（1）根據圖示中目的基因兩端限制酶的酶切位點以及質粒上限制酶的酶切位點可知獲得含有目的基因的重組DNA分子，需用EcoRI和XhoI兩種酶分別切割表達載體和含有目的基因的片段，以保證載體和目的基因能形成相同的黏性末端，并用DNA連接酶將它們連接。

（2）把構建好的重組DNA分子導入到受體細胞，用適宜濃度的氯化鈣處理受體細胞增加細胞壁的通透性，目的是使受體細胞成為感受態，使表達載體容易進入受體細胞，以增加轉化的成功率。

（3）篩選含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受體細胞，先將菌液涂布在含有Kan的培養基中培養，然后將所有菌落轉移至含有Amp的培養基中培養，最后挑選出目的菌落。

（4）菌種的臨時保藏需在無菌操作下將目的單菌落用接種環取出，再用劃線法接種在斜面上，37°C培養24小時后，置于4°C冰箱中保存。

（5）農桿菌在自然條件下可感染雙子葉植物和裸子植物，所以若受體細胞為雙子葉植物，常用農桿菌轉化法將目的基因導入植物體細胞，再將體細胞進行組織培養，得到轉基因植物。