Question

【題目】人類酸性成纖維細胞生長因子（aFGF）在轉基因植物中的表達量普遍較低，某科研小組通過添加增強子（增強它所調節(jié)基因的轉錄頻率）、polyA序列（提高mRNA的穩(wěn)定性）等表達控制元件提高了aFGF基因在紫花苜蓿細胞中的表達量。下圖表示操作的基本過程，質粒外面標注了限制酶酶切位點，質粒里面標注了相關的結構和基因（其中Kanr代表卡那霉素抗性基因）。請回答問題。

（1）①②過程構建重組質粒都需要使用限制酶和___________，限制酶酶XhoⅠ的識別序列是-C↓TCGAG-，aFGF基因被限制酶XhoⅠ切割后形成的黏性末端是____________。

（2）圖中質粒均未標出_________（填結構名稱）；X、Y、Z三個酶切位點中，_________的酶切位點與其他兩點不同。

（3）③過程用________預先處理農桿菌，可提高質粒4的導入率；進行④過程前，需提取農桿菌DNA，通過PCR進行基因擴增，鑒定其是否含目的基因，其設計引物的依據(jù)是__________________。

（4）轉化后的紫花苜蓿外植體需經過_________過程才能長成完整植株，若長大后的轉基因紫花苜蓿的aFGF表達量明顯提高，請分析原因: _______________________。

Answer 1

【答案】 DNA連接酶 復制原點 Z Ca2+（或CaCl2） aFGF基因兩端的堿基序列 脫分化、再分化 增強子提高了aFGF 基因轉錄的頻率，植物偏好的密碼子合成的aFGF基因及polyA序列提高了翻譯的效率

【解析】試題分析：本題結合圖解，考查基因工程的相關知識，要求學生識記基因工程的操作步驟及各步驟中需要注意的細節(jié)，能正確分析題圖，從圖中提取信息準確答題，屬于考綱理解和應用層次的考查。基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。（3）將目的基因導入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）重組質粒構建過程中需要使用限制酶和DNA連接酶，限制酶XhoⅠ的識別序列是一C↓TCGAG—，aFGF基因被限制酶XhoⅠ切割后形成的黏性末端是。

（2）圖中質粒標出了啟動子、終止子、抗性標記基因，但沒有標出復制原點；①過程使用的限制酶是KpnI、XhoI ，所以X是KpnI的酶切位點，②過程使用的限制酶是XbaI、EcoRI，所以Y、Z分別是KpnI、XhoI的酶切位點，因此X、Y、Z三個酶切位點中，Z的酶切位點與其他兩點不同。

（3）目的基因導入微生物細胞時，用Ca2+處理可提高轉化率，通過PCR鑒定農桿菌內是否含有aFGF基因，其本質就是要擴增出aFGF基因，所以設計引物的依據(jù)是aFGF基因兩端的堿基序列。

（4）外植體在植物組織培養(yǎng)過程中需經過脫分化和再分化才能長成完整植株，因為增強子提高了aFGF基因轉錄的頻率，植物偏好的密碼子合成的aFGF基因及polyA序列提高了翻譯的效率，所以長大后的轉基因紫花苜蓿的aFGF表達量明顯提高。