Question

【題目】蜘蛛絲中強(qiáng)度最好的牽引絲由主壺腹腺蛛絲蛋白（MaSp）組成。MaSp包括MaSp1、MaSp2兩個(gè)組分。完整的MaSp1蛋白可分NT、RP、CT三個(gè)部分。研究者以大腹園蛛MaSp1的NT等為研究對(duì)象做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以期了解大腹園蛛MaSp1的結(jié)構(gòu)和成絲機(jī)理。實(shí)驗(yàn)流程圖如圖所示。請(qǐng)回答問(wèn)題：

（1）蜘蛛凍存之前通常要用滅菌蒸餾水清洗、饑餓等處理，其目的是______________；取凍存大腹園蛛的胸部組織搗碎，提取該蜘蛛的______________。

（2）在僅知黑寡婦蜘蛛和摩鹿加云斑蛛MaSp1基因編碼序列的情況下，研究者對(duì)比兩者NT中的氨基酸序列，根據(jù)其中共有的一段含有7個(gè)氨基酸的保守序列，推測(cè)對(duì)應(yīng)的DNA序列，據(jù)此設(shè)計(jì)出長(zhǎng)度為________個(gè)堿基的引物1。獲取該引物常用________方法。

（3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，經(jīng)25～30輪擴(kuò)增循環(huán)后，由于模板的增多，________的數(shù)量會(huì)逐漸成為制約反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行的主要限制性因素。

（4）流程圖中的空白處指構(gòu)建________，然后將該結(jié)構(gòu)導(dǎo)入________態(tài)的大腸桿菌。

（5）分離、純化NT蛋白時(shí)，為何不直接從培養(yǎng)液中提取，而是將表達(dá)該蛋白的工程菌破碎？_______________________________________

Answer 1

【答案】減少外源DNA的干擾 基因組DNA 21 化學(xué)方法（人工）合成 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶） 基因表達(dá)載體（ 或重組質(zhì)粒） 感受 大腸桿菌（缺少信號(hào)肽、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等）不分泌NT蛋白

【解析】

1、PCR技術(shù)的基本原理利用DNA體外雙鏈復(fù)制的原理，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的引物。

PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。

2、基因工程的操作步驟：提取目的基因、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。

（1）蜘蛛凍存之前通常要用滅菌蒸餾水清洗、饑餓等處理，其目的是減少外源DNA的干擾，獲取目的基因的方法包括從自然界已有的物種中分離和人工合成法，因此取凍存大腹園蛛的胸部組織搗碎，可以從中提取該蜘蛛的基因組DNA。

（2）根據(jù)題意可知，研究者對(duì)比兩者NT中的氨基酸序列，根據(jù)其中共有的一段含有7個(gè)氨基酸的保守序列，推測(cè)對(duì)應(yīng)的DNA序列，根據(jù)氨基酸與密碼子的對(duì)應(yīng)關(guān)系可知，則設(shè)計(jì)出引物的長(zhǎng)度為7×3=21個(gè)堿基的引物1，常用化學(xué)合成法合成引物。

（3）根據(jù)以上分析可知，PCR擴(kuò)增過(guò)程中需要的條件為：模板、引物、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、dNTP為反應(yīng)原料等，因此經(jīng)25～30輪擴(kuò)增循環(huán)后，由于模板的增多，熱穩(wěn)定DNA聚合酶的數(shù)量會(huì)逐漸成為制約反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行的主要限制性因素。

（4）識(shí)圖分析可知，圖紙空白處為基因表達(dá)載體的構(gòu)建，基因表達(dá)載體構(gòu)建完成后導(dǎo)入受體細(xì)胞，大腸桿菌為微生物，可以用鈣離子轉(zhuǎn)化法處理，使大腸桿菌處于感受態(tài)，便于吸收周圍環(huán)境中的DNA分子。

（5）由于大腸桿菌為原核生物，沒(méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器，不能對(duì)分泌蛋白進(jìn)行加工和分泌，因此大腸桿菌不能分泌NT蛋白，故分離、純化NT蛋白時(shí)，不直接從培養(yǎng)液中提取，而是將表達(dá)該蛋白的工程菌破碎處理后提取。