Question

【題目】人乳鐵蛋白（hLF）對細菌、真菌和病毒等都有抑制作用。研究人員開展人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達載體構建及轉染研究，主要流程如下圖，圖中Ase I Nhe I、Sal I、BamH I代表相關限制酶切點，neo′為新霉素抗性基因，BLG基因為β-乳球蛋白基因，GFP基因為綠色熒光蛋白基因。請回答：

（1）過程①中，不能從人肌肉細胞中提取RNA用于RT-PCR，是因為_________。在RT-PCR過程中，加入的引物需在5'端添加____________兩種限制酶的識別序列，以便于hLF基因插入pEB中。

（2）過程②中，hLF基因插入到BLG基因之后的目的是______________。過程③中，使用人工膜制成的脂質體將重組質粒導入受體細胞，依據的主要原理是_____________。

（3）將轉染后的山羊乳腺上皮細胞先置于含新霉素的培養液中培養，能夠存活的細胞應該是導入____________的細胞，再利用熒光顯微鏡觀察山羊乳腺上皮細胞中___________，以篩選出轉染成功的細胞。

（4）要獲得轉基因山羊，還需要將成功表達hLF的乳腺上皮細胞的細胞核移植到山羊__________細胞中，再借助_____________技術孕育出羊羔。

Answer 1

【答案】hLF基因在人肌肉細胞中不轉錄（表達） Sal I和BamH I 使人乳鐵蛋白基因在山羊的乳腺細胞中表達 生物膜具有一定的流動性 pEB質粒或pEBL質粒 是否有綠色熒光 去核的卵母 早期胚胎培養和胚胎移植

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）人肌肉細胞使高度分化的細胞，hLF基因在人肌肉細胞中不轉錄（表達），故過程①中，不能從人肌肉細胞中提取RNA用于RT-PCR。Sal I和BamH I在質粒上挨著，切割質粒不破壞其他基因，故在RT-PCR過程中，加入的引物需在5'端添加Sal I和BamH I兩種限制酶的識別序列，以便于hLF基因插入pEB中。

（2）過程②重組載體的構建，hLF基因插入到BLG基因之后的目的是使人乳鐵蛋白基因在山羊的乳腺細胞中表達。過程③重組載體導入受體細胞，使用人工膜制成的脂質體將重組質粒導入受體細胞，依據的主要原理是生物膜具有一定的流動性。

（3）neo′為新霉素抗性基因，具有抗新霉素的作用，故將轉染后的山羊乳腺上皮細胞先置于含新霉素的培養液中培養，能夠存活的細胞應該是導入pEB質粒或pEBL質粒的細胞，GFP基因為綠色熒光蛋白基因，作為標記基因，可再利用熒光顯微鏡觀察山羊乳腺上皮細胞中是否有綠色熒光，以篩選出轉染成功的細胞。

（4）要獲得轉基因山羊，還需要將成功表達hLF的乳腺上皮細胞的細胞核移植到山羊去核卵母細胞中，再借助早期胚胎培養和胚胎移植技術孕育出羊羔。