Question

【題目】苧麻纖維被普遍應用于紡織和造紙行業,但其中含有的膠質必須被去除；與傳統的高溫堿煮相比，芽孢桿菌產生的堿性果膠酶用于苧麻脫膠具有降低能耗和化學污染的優勢，因此獲得高表達的堿性果膠酶基因工程菌，低成本生產堿性果膠酶對于紡織工業節能減排具有重要的意義。請回答下列問題：

（1）芽孢桿菌在產生堿性果膠酶的同時會分泌出對纖維有害的內源性纖維素酶，因此將堿性果膠酶基因pel轉入畢赤酵母中表達，該過程需要_________________（工具酶）和載體，作為載體必須具備能夠在宿主細胞內復制并穩定保存，以及______________(至少答出兩點)等條件。

（2）構建的基因表達載體應含有畢赤酵母的啟動子作為_____________酶識別和結合的部位，從而啟動目的基因的表達；同時還應含有標記基因，其作用是___________________。

（3）將基因表達載體導入畢赤酵母時，應采用_______________________處理，使其處于________________________________。

（4）目的基因在受體細胞是否能翻譯出蛋白質，可用______________技術來檢測。也可將導入目的基因的畢赤酵母接種于果膠底物平板上28℃培養， 2–3 d 后觀察結果如下圖（A為剛接種時，B為培養2–3d后），水解圈越大代表___________________________。

Answer 1

【答案】 限制酶和DNA連接酶 具有特定的限制酶切割位點、具有某些標記基因 RNA聚合 將含有基因表達載體的畢赤酵母篩選出來 鈣離子（Ca2＋） 感受態 抗原-抗體雜交 對應菌株產酶能力越強（或“對應菌株產酶數量越多”）

【解析】本題以堿性果膠酶高產菌株的構建為背景，綜合考查學生對DNA重組技術的基本工具、基因工程的基本操作程序等相關知識的識記和理解能力。

(1) 將堿性果膠酶基因pel（目的基因）轉入畢赤酵母（受體細胞）中表達，該過程需要構建基因表達載體，此時需要限制酶和DNA連接酶作為工具酶。作為載體必須具備的條件是：一是在宿主細胞中進行自我復制，或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA進行同步復制，即能在宿主細胞中穩定保存并大量復制，以便提供大量的目的基因；二是具有特定的（或一個至多個）限制酶切點，以供外源DNA片段（目的基因）插入其中；三是具有某些標記基因，以便供重組DNA的鑒定和選擇。

(2)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，標記基因的作用是將含有基因表達載體的畢赤酵母（受體細胞）篩選出來。

(3) 畢赤酵母屬于單細胞的微生物；將基因表達載體導入畢赤酵母時，應采用鈣離子（Ca2＋）處理畢赤酵母，使其處于感受態。

(4) 目的基因在受體細胞是否能翻譯出蛋白質，可用抗原-抗體雜交技術來檢測。導入目的基因的畢赤酵母產生的堿性果膠酶能水解平板上的果膠，形成水解圈；水解圈越大，代表對應菌株產酶能力越強（或“對應菌株產酶數量越多”）。